ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Kimyoviy sanoat kimyoviy komponenti uchun dupleks payvandlangan trubka, SPECC1L etishmovchiligi birlashtirilgan bo'g'inlarning barqarorligini oshirishga va kranial asab hujayralarining to'kilishini kamaytirishga olib keladi.

Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydigan brauzer versiyasidan foydalanmoqdasiz.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptlarsiz ko'rsatamiz.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Kimyo sanoati uchun dupleks payvandlangan quvur

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.zanglamaydigan po'latdan yasalgan choksiz quvurlar, yorqin tavlangan quvurlar, choksiz o'ralgan quvurlar va boshqalar bo'yicha ixtisoslashgan etakchi ishlab chiqaruvchi hisoblanadi.Mijozlarni osonlashtirish uchun bizda payvandlangan quvurlar va quvurlar ham mavjud.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.eng ilg'or ishlab chiqarish va sinov uskunalariga ega.Biz sizning talabingizni to'liq qondira olamiz.Standartga ko'ra, biz ishlab chiqargan quvurlar har doim to'g'ri OD va WT bardoshliklariga ega.Tolerantlik nazorati ishlab chiqarish standartlariga qat'iy muvofiqdir.Mahsulotlarimiz doimo mijozlardan mamnun.Mijozlar mahsulotimizni sotib olishdi, ko'proq foyda keltirdi.
a) OD (tashqi diametri): 3,18 mm dan 101,6 mm gacha
b) WT (devor qalinligi): 0,5 mm dan 20 mm gacha
c) Uzunlik: mijozning talabiga binoan
d) Standartlar: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 va boshqalar
e) Jarayon usuli: ERW, EFW va boshqalar

Har bir slaydda uchta maqolani ko'rsatadigan slayderlar.Slaydlar boʻylab harakatlanish uchun “Orqaga” va “Keyingi” tugmalaridan yoki har bir slayd boʻylab harakatlanish uchun oxiridagi slaydni boshqarish tugmalaridan foydalaning.
Boshsuyagi nerv tepa hujayralari (CNCC) embrion nerv burmalarini yo'qotadi va o'rta yuz tuzilmalarining ko'p qismini tashkil etuvchi faringeal yoylarga o'tadi.CNCC disfunktsiyasi orofasiyal yoriq etiologiyasida muhim rol o'ynaydi, keng tarqalgan konjenital malformatsiya.Atipik va sindromli yoriqlari bo'lgan bemorlarda geterozigotali SPECC1L mutatsiyalari aniqlangan.Bu erda biz kanonik yopishtiruvchi birikma (AJ) komponentlarini, ekilgan SPECC1L yiqitish hujayralarida b-katenin va E-kaderinning yaxshilangan bo'yalishini xabar qilamiz va elektron mikrografiyada AJ ning apikal-bazal diffuziyasi ko'rsatilgan.SPECC1L ning kraniofasiyal morfogenezdagi rolini tushunish uchun biz Specc1l yetishmaydigan sichqoncha modelini yaratdik.Gomozigot mutantlar embrionni o'ldiradigan bo'lib, asab naychalarining yopilishi va CNCC laminatsiyasining buzilishini ko'rsatadi.Mutant nerv burmalarida AJ oqsilining bo'yalishi kuchayadi.Ushbu AJ nuqsoni CNCC delaminatsiyasidagi nuqson bilan mos keladi, AJ eritmasini talab qiladi.Bundan tashqari, Specc11 mutantlari PI3K-AKT signalini kamaytirdi va apoptozni kuchaytirdi.In vitro, yovvoyi turdagi hujayralardagi PI3K-AKT signalizatsiyasining engil inhibisyonu AJ o'zgarishlarini keltirib chiqarish uchun etarli edi.Muhimi, SPECC1L yiqitish natijasida kelib chiqqan AJ o'zgarishlarini PI3K-AKT yo'lini faollashtirish orqali qaytarish mumkin.Birgalikda olingan ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, SPECC1L PI3K-AKT signalizatsiyasi va AJ biologiyasining yangi regulyatori sifatida asab naychasini yopish va CNCC tabaqalanishi uchun zarurdir.
Boshsuyagi neyrokrest hujayralari (CNCCs) dorsal neyroektodermada lokalizatsiya qilinadi va epiteliya-mezenximal o'tish (EMT) 1,2,3 bilan bog'liq jarayon orqali rivojlanayotgan nerv burmalarining neyroepiteliysidan ajralib chiqadi.Premigratsiya qiluvchi epitelial CNCCs hujayralararo birikmalarni buzadi va birinchi va ikkinchi faringeal yoylarni to'ldiradigan va kraniofasiyal xaftaga ko'p qismini tashkil etuvchi ko'chib yuruvchi mezenximal CNCCsga aylanadi.Shunday qilib, CNCC funktsiyasini tartibga soluvchi genlar ko'pincha orofasiyal yoriqlar kabi kraniofasiyal konjenital anomaliyalarning etiologiyasida buziladi, ko'pincha AQShda 1/800 tug'ilishga ta'sir qiladi.Tug'ma nuqsonlardan biri8.
CNCC ning delaminatsiyasi sichqonlarda embrion rivojlanishining 8,5 dan 9,5 kungacha oldingi nerv naychasining yopilishiga to'g'ri keladi.Sichqonchaning orofasial yoriqlari bilan bog'langan bir qator genlarning mutantlari, shuningdek, Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 va Pdgfra12 kabi nerv naychalari nuqsonlarining ayrim shakllarini ko'rsatadi.Shu bilan birga, asab naychasining yopilishi va CNCC tabaqalanishi jarayonlarini mustaqil deb hisoblash mumkin, chunki Splotch mutant sichqonchasi (Pax3) CNCC tabaqalanishi yoki migratsiyasiga hech qanday ta'sir ko'rsatmasdan neyral naychani yopishda nuqsonlarni ko'rsatadi 13,14.CNCC dissektsiyasi va asab naychasini yopishda nuqsonlari bo'lgan qo'shimcha sichqoncha modellari ushbu ikki jarayonning umumiy molekulyar asosini aniqlashga yordam beradi.
CNCC ni neyroepitelial hujayralardan izolyatsiya qilish uchun E-kaderin, b-katenin, a-E-katenin va aktin filamentlari 2 bilan bog'liq bo'lgan a-aktininni o'z ichiga olgan oqsil komplekslaridan tashkil topgan yopishqoq birikmalar (AJs) eritilishi kerak. Nerv burmalarida E-kaderinning haddan tashqari ekspressiyasini o'rganish CNCC delaminatsiyasining pasayishi yoki kechikishini ko'rsatdi.Aksincha, E-kaderinning bostirilishi erta tabaqalanishga olib keladi15,16.CNCC tabaqalanishida EMTga vositachilik qiluvchi omillarning aksariyati transkripsiya omillari (AP2a, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) va matritsa metalloproteinazalari (MMPs) kabi hujayradan tashqari matritsani (ECM) qayta tashkil etuvchi oqsillardir, ammo CNCCs to'g'ridan-to'g'ri sitoskeletal AJ hisoblanadi. hali ma'lum emas.PI3K-AKT yo'li E-kaderin darajasini, asosan, saraton tadqiqotlaridan antagonize qilish uchun ma'lum.So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, sichqonlarda PDGFa-ga asoslangan PI3K-AKT signalizatsiyasining yo'qolishi kraniofasiyal anomaliyalarga, shu jumladan tanglay yorig'i va asab naychalari nuqsonlariga olib keladi12.Biroq, PI3K-AKT yo'li va CNCC tabaqalanishidagi AJ barqarorligi o'rtasidagi munosabat aniq emas.
Biz ilgari SPECC1L ni og'izdan ko'zgacha cho'zilgan og'ir yoriq (ObFC) yoki Tessier IV18 yorig'i sifatida tanilgan ikki kishidagi birinchi mutant gen sifatida aniqlagan edik.SPECC1L mutatsiyalari avtosomal dominant Opitz G/BBB sindromi (OMIM #145410) boʻlgan ikkita koʻp avlod oilalarida aniqlangan, bunda taʼsirlangan shaxslarda giperdistantsiya va lab/tanglay yorigʻi19 va Tibining ortiqcha masofa sindromi boʻlgan bir oilada (OMIM #145420)20 aniqlangan. .Opitz G/BBB sindromi holatlarining yarmidan ko'pi X-bog'langan (OMIM #300000) va mikronaychalar bilan bog'langan hujayra skeletining 22-oqsilini kodlaydigan MID1 genidagi mutatsiyalar tufayli yuzaga keladi.Biz faraz qilamizki, SPECC1L, shuningdek, mikrotubulalar va aktin sitoskeleti bilan bog'liq bo'lgan oqsil, hujayra yopishishi va migratsiyasi 18 paytida aktin sitoskeletini qayta qurish uchun zarur bo'lgan signalizatsiyaga vositachilik qilishi mumkin.In vitro va in vivo tadqiqotlar orqali biz SPECC1L ni PI3K-AKT signalizatsiyasi orqali AJ barqarorligining yangi regulyatori sifatida tasvirlaymiz.Hujayra darajasida SPECC1L etishmovchiligi pan-AKT oqsili darajasining pasayishiga va AJ ning apikal-bazal dispersiyasining oshishiga olib keldi, bu AKT yo'lining kimyoviy faollashuvi bilan bartaraf etildi.In vivo, Specc11 etishmayotgan embrionlarda asab naychalari yopilishi buzilgan va CNCC diseksiyonu kamayadi.Shunday qilib, SPECC1L yuzning morfogenezi davomida normal CNCC funktsiyasi uchun zarur bo'lgan yuqori darajada tartibga solinadigan hujayra yopishqoqligiga asoslangan signalizatsiyada ishlaydi.
SPECC1L ning hujayra darajasidagi rolini tavsiflash uchun biz SPECC1L18 da kam bo'lgan ilgari tasvirlangan barqaror osteosarkoma hujayra liniyasi U2OS dan foydalandik.SPECC1L (kd) nokdaunga uchragan bu barqaror U2OS xujayralari SPECC1L transkriptlari va oqsillari darajasida o'rtacha (60-70%) pasayish bilan birga aktin sitoskeletonining migratsiya va qayta tashkil etilishidagi nuqsonlar bilan bir qatorda 18. Aksincha, kuchli vaqtinchalik pasayish kuzatildi. SPECC1L mitotik nuqsonlarga olib kelishi ko'rsatilgan 23 .Keyinchalik tavsiflangandan so'ng, biz barqaror SPECC1L-kd hujayralarimiz morfologiyani juda yuqori darajada qo'shilish darajasida o'zgartirganligini aniqladik (1-rasm).Individual nazorat hujayralari va kd xujayralari past qo'shilishda o'xshash edi (1A, D-rasm).Birlashgandan keyin 24 soat o'tgach, nazorat hujayralari kuboid shaklini saqlab qoldi (1B, E-rasm), SPECC1L-kd hujayralari esa cho'zilgan (1C, F-rasm).Hujayra shaklidagi bu o'zgarish darajasi nazorat hujayralari va kd hujayralarining in vivo jonli tasviri orqali olingan (1-film).SPECC1L ning qo'shilgan hujayralardagi rolini aniqlash uchun avval uning ifodasini ko'rib chiqdik.Biz SPECC1L protein darajasi termoyadroviydan keyin ortganini aniqladik (1G-rasm), SPECC1L transkript darajasi esa oshmadi (1H-rasm).Bundan tashqari, hujayra zichligi oshgani sayin, SPECC1L oqsili hujayralararo chegaralarda to'plangan (2A-E-rasm), membrana bilan bog'langan b-katenin bilan bir-biriga mos keladigan naqsh (2A'-E'-rasm).SPECC1L ning aktin sitoskeleton 18,23 bilan bog'lanishini hisobga olib, biz SPECC1L aktinga asoslangan yopishtiruvchi birikmalar (AJ) bilan o'zaro ta'sir qiladi deb taxmin qildik.
(AF) SPECC1L demontaj (DF) hujayralari nazorat U2OS hujayralariga (AC) nisbatan yuqori qo'shilishda (F) cho'ziladi.Bu erda biz turli hujayra zichligi uchun tanlagan oltita vaqt nuqtasidan uchtasi (T1, T3, T6) ko'rsatilgan.(G) Western blot tahlili, SPECC1L oqsili nazorat hujayralarida past darajadagi qo'shilish darajasiga nisbatan yuqori darajadagi qo'shilish darajasida barqarorlashganligini ko'rsatadi.SPECC1L ning g'arbiy bloti kutilgan 120 kDa diapazoni va yuqori molekulyar og'irlik diapazoni ko'rsatadi, ehtimol post-translational modifikatsiyalangan (*).Western blot tahlili past va yuqori qo'shilish uchun bir xil sharoitlarda amalga oshirildi.SPECC1L ni past va yuqori qo'shilishda ko'rsatadigan tasvirlar bir xil dog'dan olingan.Xuddi shu dog' olib tashlandi va b-aktin antikori bilan qayta tekshirildi.(H) Kantitativ RT-PCR tahlili SPECC1L transkript darajasida sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatmadi.Xato satrlari to'rtta mustaqil tajribadan olingan SEMlarni ifodalaydi.
(AE) SPECC1L nokdaunti (kd) bilan U2OS hujayralarida hujayra shakli tahlilini va AJ o'zgarishlarini normallashtirish uchun hujayra zichligi oralig'ini ifodalovchi oltita vaqt nuqtasini (T1-T6) tanladik.Ushbu vaqt nuqtalarining dastlabki beshtasiga bitta hujayralar (T1), kichik hujayralar klasterlarining 50-70% sintezi (T2), kd hujayralarini qayta shakllantirmasdan sintez (T3), kd hujayralarini qayta shakllantirish (T4) va 24 soatlik o'zgarishlar kiradi.kd (T5) hujayralarining posterior shaklida.SPECC1L oqsili asosan T1 (A) da sitoplazmada tarqalgan, ammo uning to'planishi hujayralararo chegaralarda keyingi vaqt nuqtalarida kuzatilgan (B-E, o'qlar).(FJ) b-katenin AJ kompleksi bilan bog'liq hujayralararo chegaralarda xuddi shunday to'planishni ko'rsatadi.(A'-E') SPECC1L va b-katenin yuqori hujayra zichligida (strelkalar) hujayra chegaralarida bir-biriga o'xshash bo'yashni ko'rsatadi.(F'-J') SPECC1L-kd hujayralarida b-kateninning bo'yalishi past hujayra zichligida (F'-H') normal ko'rinadi, lekin hujayra shakli o'zgarganda (I', J'; o'qlar) kengayadi, bu AJ ekanligini ko'rsatadi. o'zgargan.Barlar = 10 mikron.
Keyin biz SPECC1L etishmovchiligining AJga ta'sirini aniqlashga harakat qildik.Biz F-aktin, miyozin IIb, b-katenin va E-kaderin24,25,26,27 kanonik komponentlarini o'z ichiga olgan bir nechta AJ bilan bog'liq markerlardan foydalandik.Aktin stress tolalari SPECC1L-kd hujayralarida ilgari tasvirlanganidek ko'paydi (3A, B-rasm) 18.Aktin filamentlari bilan bog'langan miyozin IIb in vitro SPECC1L-kd hujayralarida xuddi shunday o'sishni ko'rsatdi (3C, D-rasm).AJ bilan bog'langan b-katenin hujayra membranasida kaderin bilan bog'lanib, nazorat kubotsitlarida oddiy "asal chuqurchalari" ifoda namunasini ko'rsatadi (3E, G-rasm).Qizig'i shundaki, konfokal mikroskopiyadan foydalangan holda tekis tasvirlarda, qo'shilgan SPECC1L etishmovchiligi bo'lgan hujayralarning hujayra membranasida b-katenin (3E, F-rasm) va E-kaderin (3G, H) bo'yalishi kengaytirilgan bo'yashning yorqin namunalarini ko'rsatdi.Kd hujayralarida AJ bilan bog'liq b-katenin bo'yalishining bu kengayishi qo'shilishda eng aniq bo'lgan, ammo hujayra shaklidagi o'zgarishlardan oldin paydo bo'lgan (2F-J, F'-J'-rasm).Ushbu kengaytirilgan AJ bo'yalishining jismoniy tabiatini aniqlash uchun biz SPECC1L-kd U2OS hujayralarining apikal-bazal yuzasida hujayra chegaralarini transmissiya elektron mikroskopi (TEM) orqali tekshirdik (3I, J-rasm).AJ (strelkalar) ni ko'rsatadigan alohida elektron zich hududlarga ega bo'lgan nazorat hujayralaridan (3I-rasm) farqli o'laroq, kd hujayralari (3J-rasm) apikobazal tekislik bo'ylab AJni ko'rsatadigan yuqori elektron zichlikdagi katta, qo'shni hududlarni ko'rsatdi..Bundan tashqari, ko'ndalang bo'limlarda biz kd hujayralarida hujayra membranasining keng qatlamlarini kuzatdik (rasm S1A, B), bu b-katenin va E-kaderin bo'yash bantlarining kengaytirilgan naqshini tushuntiradi (3F, H-rasm).AJlarda SPECC1L rolini qo'llab-quvvatlash uchun b-katenin birlashtirilgan U2OS hujayralarining lizatlarida SPECC1L bilan birgalikda immunoprecipitatsiya qilindi (3K-rasm).AJ markerlari uchun kengaytirilgan immuno-bo'yash bilan bir qatorda, TEM tahlili SPECC1L etishmovchiligi AJ apikal-bazal zichligi va dispersiyasini oshiradi degan gipotezamizga mos keldi.
(AH) termoyadroviydan 48 soat o'tgach, kd hujayralarida F-aktin bo'yashining kuchayishi (T6; A, B).F-aktin (C, D) bilan bog'liq miyozin IIb ning o'zgartirilgan bo'yalishi.Nazorat hujayralarida (E, G) b-katenin va E-kaderin membranasini bo'yashning silliq naqshlari SPECC1L-kd (F, H) hujayralarida yaxshilandi.Barlar = 10 mikron.(I-J) Apikal-bazal hujayralararo birikmani kuzatuvchi elektron mikrografiyalar.Nazorat hujayralari yopishqoq birikmalarni ko'rsatadigan aniq elektron zich hududlarni ko'rsatadi (I, o'qlar).Bundan farqli o'laroq, SPECC1L-kd hujayralarida butun apikal-bazal birikma elektron zichligi (J, o'qlar) paydo bo'lib, bu zichlik va yopishqoq birikmalarning tarqalishini ko'rsatadi.(K) b-katenin qo'shilgan U2OS hujayra lizatlarida SPECC1L bilan birgalikda immunoprecipitatsiya qilingan.To'rtta mustaqil tajribadan birini ifodalovchi bir nuqtadan olingan rasm.
SPECC1L ning kraniofasiyal morfogenezdagi rolini tushunish uchun biz ikkita mustaqil ES tuzoq hujayra liniyasi, DTM096 va RRH048 (BayGenomics, CA) yordamida Specc1l etishmovchiligi bo'lgan sichqoncha modelini yaratdik, ular intron 1 va Specc1l transkriptlari 115-rasmda olingan. .4A, S2 rasm).Aldash vektor qo'shimchasining genomik joylashuvi butun genom ketma-ketligi bilan aniqlandi va PCR bilan tasdiqlandi (S2-rasm).Ikkala gen tuzog'i dizayni ham qo'lga olingandan so'ng Specc11-lacZ muxbirlarining ramka ichida birlashishiga imkon berdi.Shuning uchun X-gal bo'yash orqali aniqlangan lacZ ifodasi Specc11 ifodasining indikatori sifatida ishlatilgan.Ikkala allel ham xuddi shunday lacZ ekspresyon naqshlarini ko'rsatdi, intron 1dagi DTM096 gen tuzog'i 15 introndagi RRH048 ga qaraganda kuchliroq ifodani ko'rsatdi (ko'rsatilmagan).Shu bilan birga, Specc1l keng tarqalgan bo'lib, E8.5 da (4B-rasm) asab burmalarida, E9.5 va E10.5 da asab naychasida va yuz jarayonlarida (4C, D-rasm) va rivojlanayotgan oyoq-qo'llarda kuchli ifodalangan. E10 da.5 va ko'zlar (4D-rasm).E10.5 da birinchi faringeal yoyda SPECC1L ifodasi CNCC nasl-nasabiga mos keladigan epiteliya va asosiy mezenxima18da mavjudligi haqida avval xabar bergan edik.CNCCda SPECC1L ifodasini sinab ko'rish uchun biz E8.5 nerv burmalarini (4E-J-rasm) va E9.5 bosh suyagi qismlarini (4K-rasm) bajardik.E8.5 da SPECC1L neyron burmalarni intensiv ravishda bo'yadi (4E, H-rasm), shu jumladan NCC belgilari bilan bo'yalgan hujayralar (4G, J-rasm).E9.5 da, SPECC1L (4K, N-rasm) kuchli bo'yalgan migratsiya CNCC AP2A (rasm 4L, M) yoki SOX10 (Fig. 4O, P) bilan birgalikda bo'yalgan.
(A) ES DTM096 (intron 1) va RRH048 (intron 15) hujayra klonlarida aldash vektor kiritilishini ko'rsatuvchi sichqoncha Specc11 genining sxematik tasviri.E8.5 dan E10.5 gacha Specc1l ifodasini ifodalovchi heterozigotli Specc1lDTM096 embrionlarining (BD) lacZ bo'yalishi.NE = neyroektoderma, NF = asab burmasi, PA1 = birinchi faringeal yoy.(EP) E8.5 (NF; EJ) nerv burmalari va E9.5 (KP) bosh suyagi qismlarida NCC belgilari AP2A va SOX10 bilan SPECC1L immuno-bo'yash.SPECC1L bo'yalishi E8.5 (E, H; o'q uchlari), shu jumladan AP2A (F, G; o'q uchlari) va SOX10 (I, J; o'q uchlari) bilan etiketlangan hujayralar neyron burmalarida keng kuzatilgan.E9.5 da SPECC1L AP2A (L, M; o'qlar) va SOX10 (O, P; o'qlar) bilan belgilangan migratsiya CNCC (K, N; o'qlar) kuchli bo'yalgan.
Geterozigotali Specc1lDTM096/+ va Specc1lRRH048/+ sichqonlari o‘rtasidagi kesishish ikkita gen tuzog‘i allellari bir-birini to‘ldiruvchi emasligini va har ikkala gen tuzog‘i alleli uchun birikma heterozigotlar va embrion gomozigotalari embrion halokatli ekanligini ko‘rsatadi (jadval S1).Mendel nisbatlari tug'ilishda heterozigotlarning omon qolish darajasining pasayishini ko'rsatdi (kutilgan 1,34 va 2,0).Biz heterozigotlar orasida past perinatal o'limni qayd etdik, ba'zilarida kraniofasiyal anomaliyalar bor edi (S3-rasm).Biroq, bu perinatal kraniofasiyal fenotiplarning past penetratsiyasi ularning asosiy patofizyologik mexanizmlarini o'rganishni qiyinlashtiradi.Shuning uchun biz homozigotli Specc11 mutantlarining embrion halokatli fenotipiga e'tibor qaratdik.
Murakkab heterozigot yoki homozigot Specc1lDTM096/RRH048 mutant embrionlarining ko'pchiligi E9.5-10.5 (5A-D-rasm) dan keyin rivojlanmagan va asab trubkasi old tomondan yopilmagan (5B, D-rasmlar) va ba'zan orqa tomondan yopilgan (ko'rsatilmagan) ..Bu kranial asab naychasini yopish nuqsoni E10.5 da asab burmalarida qolgan DLX2 bilan belgilangan CNCC ko'pchiligi bilan bog'liq bo'lib, bu diseksiyonning yo'qligini ko'rsatadi (5A'-D'-rasm).CNCC ning umumiy o'lchami ham kamayganligini aniqlash uchun biz Wnt1-Cre va ROSAMTmG bilan gen tuzoqlari qatorida GFP bilan CNCC chiziqlarini belgiladik.Biz butun embrionlardan saralangan GFP+ NCC va GFP- (RFP+) NCC bo'lmagan translyatsiya qilamiz.E9.5 da, oqim bo'yicha saralangan GFP etiketli CNCCs ulushi WT va mutant embrionlar (ko'rsatilmagan) o'rtasida sezilarli darajada o'zgarmadi, bu normal CNCC spetsifikatsiyasini ko'rsatadi.Shuning uchun, biz fosh nerv burmalarida qoldiq Wnt1-Cre va DLX2 bo'yalishi (5B'-rasm) SPECC1L-kd hujayralarida ko'rinib turganidek, AJ hujayralarining zichligi yoki tarqalishining ortishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin bo'lgan CNCC qatlamining nuqsonli bo'lishi bilan bog'liq deb taxmin qildik.Nerv katlamida CNCC mavjudligini tasdiqlash uchun SOX10, AP2A va DLX2 NCC belgilaridan foydalandik (5E-R-rasm).E8.5 da, barcha uch NCC markerlari uchun neyron qatlamli bo'yash WT (5E, G, I-rasm) va Specc1l mutant (5F, H, J-rasm) bo'limlarida kuzatildi.E9.5 da, NCC markerlari WT bo'limlarida ko'chib yuruvchi NCCni bo'yab qo'ygan bo'lsa (5M, O, Q-rasm), Specc1l mutant embrionlarining ochiq nerv burmalarida qoldiq NCC bo'yalishi kuzatildi (5N, P, R-rasm).SOX10 va DLX2 migratsiyalangan CNCC-larni belgilaganligi sababli, bu natija SPECC1L etishmayotgan CNCC-lar migratsiyadan keyingi spetsifikatsiyaga erishadi, ammo neyron burmalaridan ko'chib o'tmaydi.
Specc11 tanqisligi neyron naychalarining nuqsonli yopilishiga, kranial asab hujayralari va AJlarning delaminatsiyasiga olib keladi.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A') bilan belgilangan migratsiya kranial asab tolasi hujayralarini (CNCC) tashuvchi embrion.Aksincha, Specc11 mutant embrionlari ochiq nerv burmalari (B), o'q uchlari) va ko'chib o'tmagan CNCC'larni (B', o'q uchlari) ko'rsatadi.(C, D') E10.5 WT embrionlarining (C, C') va Specc1l (D, D') CNCC belgisi DLX2 ning yorqin maydon tasvirlari (C, D') va immuno-bo'yash (C', D').WT E10.5 embrionlarida DLX2-musbat CNCC gill yoylarini (C', o'qlar) kolonizatsiya qiladi, mutantlarda esa ochiq nerv burmalarida (D', o'qlar) va birinchi faringeal yoylarda (D', o'qlar).) CNCC ning zaif delaminatsiyasi va migratsiyasini ko'rsatadigan ba'zi bo'yash (strelkalar) bilan.ER) WT va Specc1l mutant embrionlarining E8.5 (E–L) va E9.5 (M–R) bosqichlarida boʻlimlari NCC markerlari SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) va DLX2 (I, J, Q, R).E8.5 da NCC bo'yalishi yovvoyi tipdagi neyron burma (NF) va mutant bo'limlarda kuzatildi.E8.5 WT (K) va mutant (L) da SOX10 va b-kateninning birgalikda bo'yalishi asab burmalaridagi hujayra chegaralarida b-kateninning bo'yalganligini aniqladi.E9.5 da, ko'chib yuruvchi CNCCs (M, O, Q) ning yovvoyi turdagi bo'yalishi kuzatildi, mutantlarda esa qatlamlanmagan CNCCs ochiq neyron burmalarni (N, P, R) bo'yadi.(S–Z) E9.5 mutatsiyasiga ega WT va Specc11DTM096/RRH048 embrionlarining koronal bo'limlarida in vivo AJ yorliqlash tahlili.Yuqori o'ng burchakda taxminiy kesma tekisligi ko'rsatilgan.Mutant to'qimalarning bo'limlarida F-aktin (S, T) va miyozin IIb (U, V) ning ko'payishi kuzatildi.3-rasmdagi in vitro natijalariga o'xshash mutant embrionlarda b-katenin (W, X) va E-kaderin (Y, Z) uchun yaxshilangan membranani bo'yash kuzatildi.(AA-BB) Yovvoyi tipdagi embrionning apikal-bazal hujayra chegarasidan tashqariga qaragan qismining elektron mikrografi yopishqoq birikmalarni ko'rsatadigan aniq elektron zich hududni ko'rsatadi (AA, o'qlar).Aksincha, Specc11 mutant embrionlarining bo'limlarida (BB, o'qlar) butun apikobazal birikma elektron zich bo'lib, zichlik va yopishqoq birikmalarning tarqalishini ko'rsatadi.
Qatlamlarning qisqarishi o'zgartirilgan AJ bilan bog'liq degan gipotezamizni sinab ko'rish uchun biz Specc1l mutant embrionlarining ochiq nerv burmalarida AJ belgilarini ko'rib chiqdik (5S-Z-rasm).Biz aktin stress tolalari (Fig. 5S, T) ortishi va aktin tolalar (Fig. 5U, V) ustida miyozin IIB binoni bir vaqtning o'zida ortib mahalliylashtirish kuzatildi.Muhimi shundaki, biz hujayralararo chegaralarda b-katenin (5W, X-rasm) va E-kaderin (5Y, Z-rasm) bo'yalganini ko'rdik.Shuningdek, biz E8.5 embrionlarining nerv burmalarida NCC ning b-katenin bo'yashini tekshirdik (5K, L-rasm).Specc1l mutant nerv burmalarida b-katenin bo'yalishi kuchliroq bo'lib ko'rindi (5L va K-rasm), bu AJ o'zgarishlari boshlanganini ko'rsatdi.E9.5 embrionlarining bosh suyagi bo'limlarining elektron mikrografiyalarida biz yana Specc1l mutant embrionlarida WT bilan solishtirganda diffuz elektron zich bo'yalganligini kuzatdik (5AA, BB va S1E-H-rasm).Birgalikda olingan bu natijalar SPECC1L-kd U2OS hujayralarida in vitro natijalarini qo'llab-quvvatlaydi va mutant embrionlarimizda aberrant AJ bo'yalishi CNCC tabaqalanishidan oldin ekanligini ko'rsatadi.
AKT faoliyati va E-kaderin barqarorligi o'rtasidagi ma'lum antagonistik munosabatni hisobga olgan holda, 17,28 biz PI3K-AKT signalizatsiyasining ishtirokini taxmin qildik.Bundan tashqari, biz ba'zi mutant embrionlarimizda E9.5-10.5 da halokatlilikdan (<5%) qochib, o'rniga E13.5 atrofida joylashadigan subepidermal blisterlarni kuzatdik (S3-rasm).Subepidermal pufakchalar PDGFRa12 asosidagi PI3K-AKT signalizatsiyasining pasayishining o'ziga xos belgisidir.Fantauzzo va boshqalar.(2014) PdgfraPI3K/PI3K mutant embrionlarida PDGFRa asosidagi PI3K faollashuvining buzilishi subepidermal pufakchalar, nerv naychalari nuqsonlari va tanglay yoriqlari fenotiplariga olib kelishi haqida xabar berdi.Darhaqiqat, pan-AKT va faol fosforlangan Ser473-AKT darajalari Specc1l mutant to'qimalarida in vivo jonli ravishda E9.5 embrion hibsga olindi (6A-D-rasm).Fosforlangan Ser473-AKT darajasining pasayishi butunlay pan-AKT in vivo (6E-rasm) va in vitro (6F-rasm) darajasining pasayishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin.In vitro pasayish faqat U2OS hujayralari hujayra shakli va AJ zichligidagi o'zgarishlar bilan kuchli birlashganda kuzatildi (6D-rasm).Shunday qilib, bizning ma'lumotlarimiz SPECC1L kraniofasiyal morfogenezda PI3K-AKT signalizatsiyasining yangi ijobiy regulyatori ekanligini ko'rsatadi.
(A-E) E8.5 (A,B) va E9.5 (C,D) bosh suyagi qismlari yoki Specc1l mutant embrionlaridan (E) E9.5 lizatlari faol fosforlangan S473-AKT va pan-AKT oqsillarini kamaytirish darajasini ko'rsatadi , nazorat WT bilan solishtirganda.Western blotting bir xil sharoitlarda yovvoyi turdagi lizatlar va mutant lizatlarda amalga oshirildi.SPECC1L uchun ko'rsatilgan tasvirlar bitta nuqtadan olingan.Xuddi shu dog' olib tashlandi va anti-pan-ACT va b-aktin antikorlari bilan qayta tekshirildi.E8.5 nerv burmalarida (A, B) Pan-AKT darajalari va E9.5 bosh suyagi qismlarida fosforlangan S473-AKT darajalari sezilarli darajada kamaydi.(F) Pan-AKT darajalari yuqori qo'shilishda yig'ilgan SPECC1L-kd U2OS hujayralarining lizatlarida xuddi shunday kamaydi.Xato satrlari uchta mustaqil Western blot miqdoridan olingan SEMlarni ifodalaydi.(GJ) E9.5 da WT embrionlarining bo'limlari KI67 bilan bo'yalgan va mos ravishda hujayra proliferatsiyasini (G, G') va kichik apoptotik faollikni (H, H') ko'rsatadigan kaspaza 3 bo'linadi.Specc11 mutant embrionlari solishtirish mumkin bo'lgan hujayra proliferatsiyasini (I) ko'rsatadi, ammo apoptozga uchragan hujayralar soni sezilarli darajada oshadi (J).
Keyin biz proliferatsiya va apoptoz belgilarini tekshirdik.WT mutantlari uchun 82,5% va KI67 bo'yash bilan o'lchangan Specc1l mutantlari uchun 86,5% proliferatsiya indeksi bilan (p <0,56, Fisher's) E9.5 embrionlarining proliferatsiyasida hech qanday farqni kuzatmadik (I bilan solishtirganda 6E, G-rasm). aniq test).Xuddi shunday, biz embrion hibsga olinmaguncha (ko'rsatilmagan) (ko'rsatilmagan) E8.5 da asab burmalarida ajralgan kaspaza 3 uchun binoni bilan o'lchangan apoptozda hech qanday farqni kuzatmadik.Aksincha, apoptoz barcha E9.5 mutant embrionlarida sezilarli darajada oshdi (6F, H va J-rasm).Apoptozning umumiy o'sishi PI3K-AKT signalizatsiyasi va erta embrion halokatliligi bilan mos keladi29,30,31.
Keyinchalik, kd hujayralarimizdagi AJ o'zgarishlarida PI3K-AKT signalizatsiyasining sababiy rolini tasdiqlash uchun biz nazorat va kd hujayralarida yo'lni kimyoviy ravishda o'zgartirdik (7A-F-rasm).Marker sifatida biz qo'shilgan SPECC1L-kd hujayralarida kuzatilgan hujayra shakli o'zgarishi fenotipidan foydalandik, biz eng uzun o'lchamning (uzunlik) mos keladigan vertikal o'lchamga (kenglik) nisbati yordamida miqdorni aniqladik.Nisbatan yumaloq yoki kuboid hujayralar uchun 1 nisbati kutilmoqda (7G-rasm).Hujayra shakliga qo'shimcha ravishda, biz AJ ga ta'sirini b-katenin bilan bo'yash orqali ham tasdiqladik (7A'-F'-rasm).Wortmannin yordamida PI3K-AKT yo'lini inhibe qilish nazorat hujayralarida (7A, C-rasm) va AJ (7A'-rasm) hujayra shaklini o'zgartirish uchun etarli edi.PI3K-AKT SC-79 faollashtiruvchisi nazorat hujayralarida hujayra shakliga (7A, E-rasm) yoki AJ kengayishiga (7A'-rasm) ta'sir ko'rsatmadi.SPECC1L-kd hujayralarida PI3K-AKT yo'lining keyingi bostirilishi apoptozning kuchayishiga olib keldi (7B, D-rasm) va in vivo og'ir mutantlarimiz bilan mos keladigan b-katenin bo'yalishining sezilarli o'sishi (7B'-rasm).Muhimi, PI3K-AKT yo'lining faollashuvi hujayra shaklini (7B, F-rasm) va AJ fenotiplarini (7B-rasm) sezilarli darajada yaxshiladi.Hujayra shaklidagi o'zgarishlar hujayra dumaloqlik nisbati (CCR) sifatida aniqlandi va yuqorida ta'riflanganidek ahamiyati uchun solishtirildi (7G-rasm).Darhaqiqat, nazorat hujayralarida (7G-rasm, CCR = 1.56) wortmannin bilan davolash hujayra shaklini sezilarli darajada o'zgartirish uchun etarli edi (7G-rasm, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) kuzatilganiga o'xshash darajada. SPECC1L da.-kd xujayralari (7G-rasm, CCR = 3.46).SPECC1L-kd hujayralarini Wortmannin bilan davolash (7G-rasm, CCR = 3.60, ahamiyatsiz) ishlov berilmagan kd hujayralaridan (7G-rasm, CCR = 3.46, ahamiyatsiz) yoki wortmannin bilan ishlov berilgan nazorat hujayralaridan (7G-rasm) muhimroq emas edi., CCR = 3,46, ahamiyatsiz) qo'shimcha ravishda hujayra uzayishiga ta'sir qiladi (7G, CCR = 3,61, ahamiyatsiz).Eng muhimi, SC-79 AKT aktivatori SPECC1L-kd hujayralarining cho'zilgan fenotipini tikladi (7G-rasm, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Ushbu natijalar SPECC1L ning PI3K-AKT signalizatsiyasini tartibga solishini tasdiqlaydi va SPECC1L ning mo''tadil pasayishi hujayra yopishqoqligiga ta'sir qiladi, kuchli pasayish esa apoptozga olib keladi (8-rasm).
(A-F') PI3K-AKT yo'li inhibitori wortmannin (C, D) yoki SC-79 faollashtiruvchisi (E, F) bilan davolash qilingan SPECC1L-kd (B, D, F) hujayralarini nazorat qilish (A, C, E) .Tuzalmagan nazorat hujayralari kubsimon (A) normal b-mushuk hujayrali bo'yalgan (A'), kd hujayralari esa cho'zilgan (B) b-mushuk bo'yalishi (B').PI3K-AKT yo'li bostirilgandan so'ng, nazorat hujayralari (C) b-mushukning kengayishi (C') bilan cho'zildi, kd hujayralari esa bizning yuqori mutatsiyaga uchragan embrionlarimizga o'xshab apoptozdan (D) o'tishni boshladi va juda yaxshilangan b-mushukni ko'rsatdi.binoni (D').PI3K-AKT yo'li faollashgandan so'ng, nazorat hujayralari kuboidal (E) bo'lib qoldi va normal b-mushuk (E') bo'yalgan, kd hujayralari esa sezilarli yaxshilangan hujayra shakli (F) va b-mushuk (F') bo'yalganligini ko'rsatdi. (G) MetaMorph dasturi yordamida hujayra shaklining o'zgarishi darajasi (AF) eng uzun o'lchamdagi (uzunlik) va mos keladigan vertikal o'lchamdagi (kenglik) hujayraning yumaloqlik nisbati (CCR) yordamida aniqlandi.Ishlov berilmagan (NT) SPECC1L-kd hujayralari (CCR = 3.46) nazorat hujayralaridan (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13) sezilarli darajada uzunroq edi.Wortning nazorat hujayralarida PI3K-AKT yo'lini inhibe qilishi hujayra shaklidagi xuddi shunday cho'zilish uchun etarli edi (CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9).Xuddi shunday, SPECC1L-kd hujayralarida SC-79 tomonidan AKT faollashuvi nazorat darajasiga (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12) hujayra uzayishini tikladi.SPECC1L-kd hujayralarining Vortmannin bilan davolashi apoptozning kuchayishiga olib keldi, ammo .da kuzatilgan davolanmagan kd (CCR = 3.46, ns) yoki wortmannin bilan ishlov berilgan nazorat hujayralari (3.61) bilan solishtirganda hujayra shakli o'zgarishi (CCR = 3.60) ko'paymadi.ns = muhim emas.+/- 50 ta hujayra uchun SEM o'lchovlari ko'rsatilgan.Statistik farqlar Student's t-test yordamida hisoblab chiqilgan.
(A) PI3K-AKT yo'lining inhibisyonu va faollashuvining sxematik tasviri, bu esa mos ravishda AJ o'zgarishi va qutqaruvga olib keladi.(B) SPECC1L tomonidan AKT oqsilini barqarorlashtirish uchun taklif qilingan model.
Premigratsion CNCC'lar AJ lizisini oldingi nerv katlamining neyroepitelial hujayralaridan ajratishni talab qiladi1,15,32.AJ tarkibiy qismlarining bo'yalishining kuchayishi va in vitro va in vivo SPECC1L etishmayotgan hujayralarda apikal-bazal AJ assimetrik taqsimotining yo'qolishi, SPECC1L ning b-kateninga jismoniy yaqinligi bilan birgalikda SPECC1L AJ mahalliy barqarorligini to'g'ri saqlash uchun ishlashini ko'rsatadi. tashkilot mushaklari.aktin sitoskeleti.SPECC1L ning aktin sitoskeleton va b-katenin bilan bog'lanishi va SPECC1L yo'qligida kondensatsiyalangan aktin filamentlari sonining ko'payishi AJ zichligining kuzatilgan ortishi bilan mos keladi.Yana bir imkoniyat shundaki, SPECC1L yetishmaydigan hujayralardagi aktin tolalari sonining ko'payishi hujayralararo kuchlanishning o'zgarishiga olib keladi.Uyali stress AJ 33 dinamikasiga ta'sir qilganligi sababli, kuchlanish o'zgarishi ko'proq tarqalgan AJ 34 ga olib kelishi mumkin.Shunday qilib, har qanday o'zgarishlar CNCC qatlamlariga ta'sir qiladi.
Wnt1 neyron tepalik hujayralarini keltirib chiqaradigan erta nerv burmalarida ifodalanadi.Shunday qilib, Wnt1-cre nasl-nasabini kuzatish NCC35 dan oldingi va migratsiyani belgilaydi.Shu bilan birga, Wnt1, shuningdek, erta asab burmalaridan olingan dorsal miya to'qimalarining klonlarini ham belgilaydi 35,36, bu bizning ochiq nerv burmalarida Wnt1 markerlari uchun E9.5 mutantlarini bo'yashimiz CNCC emasligini ehtimol qiladi.NCC markerlari AP2A va SOX10 uchun ijobiy bo'yashimiz Specc11 mutant embrionlarining ochiq nerv burmalarida haqiqatan ham CNCC borligini tasdiqladi.Bundan tashqari, AP2A va SOX10 erta migratsiya qiluvchi NCC belgilari bo'lganligi sababli, ijobiy bo'yash bu hujayralar E9.5 tomonidan tabaqalanishi mumkin bo'lmagan migratsiyadan keyingi CNCC ekanligini ko'rsatdi.
Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, AJ ning SPECC1L tomonidan molekulyar regulyatsiyasi PI3K-AKT signalizatsiyasi orqali amalga oshiriladi.SPECC1L etishmovchiligi bo'lgan hujayralar va to'qimalarda AKT signalizatsiyasi kamayadi.Fantauzzo va boshqalarning topilmalari.kraniofasiyal morfogenezda PI3K-AKT signalizatsiyasi uchun bevosita rolni qo'llab-quvvatlaydi.(2014) PDGFRa-ga asoslangan PI3K-AKT signalizatsiyasining faollashuvining yo'qligi tanglayning yoriq fenotipiga olib kelishini ko'rsatdi.Shuningdek, biz PI3K-AKT yo'lining inhibisyonu U2OS hujayralarida AJ va hujayra shaklini o'zgartirish uchun etarli ekanligini ko'rsatamiz.Bizning topilmalarimizga muvofiq, Cain va boshqalar.37, endotelial hujayralardagi PI3K a110 subbirligining pastga regulyatsiyasi "bog'lanish indeksi" ning o'sishi deb ataladigan pericellular b-katenin bo'yalishining shunga o'xshash o'sishiga olib kelishini ko'rsatdi.Biroq, aktin filamentlari allaqachon yuqori darajada tashkil etilgan endotelial hujayralarda PI3K-AKT yo'lining bostirilishi bo'shashgan hujayra shakliga olib keladi.Aksincha, SPECC1L-kd U2OS hujayralari cho'zilgan hujayra shaklini ko'rsatdi.Bu farq hujayra turiga xos bo'lishi mumkin.PI3K-AKT signalizatsiyasini bostirish aktin sitoskeletoniga doimiy ta'sir ko'rsatsa-da, hujayra shakliga ta'siri markaziy aktin tolalarining zichligi va tuzilishidagi o'zgarishlar natijasida yuzaga keladigan kuchlanishning o'zgarishi bilan belgilanadi.U2OS hujayralarida biz SPECC1L yetishmaydigan AJ o'zgarishi va tiklanishining belgisi sifatida faqat hujayra shaklidagi o'zgarishlardan foydalandik.Xulosa qilib aytganda, biz SPECC1L etishmovchiligida AKT yo'lining inhibisyonu AJ barqarorligini oshiradi va CNCCda delaminatsiyani kamaytiradi deb taxmin qilamiz.
Qizig'i shundaki, pan-AKT darajalari SPECC1L yo'qligida fosforlangan 473-AKT darajalariga qo'shimcha ravishda in vitro va in vivo jonli ravishda kamaydi, bu AKT oqsilining barqarorligi yoki aylanishi darajasida PI3K-AKT signalizatsiyasini tartibga solishni taklif qiladi.Opitz / GBBB sindromi bilan bog'liq bo'lgan SPECC1L va MID1 genlari mikrotubulalar 18,22 stabillashadigan oqsillarni kodlaydi.SPECC1L va MID1 mikrotubula stabilizatsiyasiga vositachilik qilish mexanizmi to'liq tushunilmagan.SPECC1L holatida, bu stabilizatsiya mikrotubulalar 18 kichik to'plamining kuchaytirilgan asetilatsiyasini o'z ichiga oladi.SPECC1L AKT kabi boshqa oqsillarni barqarorlashtirish uchun shunga o'xshash mexanizmdan foydalanishi mumkin.AKT oqsilidagi lizin qoldiqlarining atsetillanishi membrana lokalizatsiyasi va fosforlanishning pasayishiga olib kelishi ko'rsatilgan38.Bundan tashqari, membranani lokalizatsiya qilish va faollashtirish uchun AKTda bir xil lizin qoldig'ida K63 zanjirining ubiquitinatsiyasi talab qilinadi39,40.Har xil yuqori quvvatli xamirturushli ikki gibrid ekranlarda aniqlangan SPECC1L oqsillari bilan o'zaro ta'sir qiluvchi bir qancha omillar orasida to'rttasi - CCDC841, ECM2942, APC va UBE2I43 - ubiquitinatsiya yoki sumoilatsiya orqali oqsil almashinuvi yoki barqarorligi bilan bog'liq.SPECC1L AKT barqarorligiga ta'sir qiluvchi AKT lizin qoldiqlarining translatsiyadan keyingi modifikatsiyasida ishtirok etishi mumkin.Biroq, AKT oqsilining lokalizatsiyasi va barqarorligida SPECC1L ning hal qiluvchi roli hali ham aniqlanmagan.
SPECC1L ifodasidagi jiddiy nuqsonlar in vivo jonli ravishda AJ markerining bo'yalishi va nuqsonli CNCC qoplamasi, shuningdek apoptoz va erta embrion halokatliligining oshishiga olib keldi.Oldingi ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, apoptoz darajasi yuqori bo'lgan sichqoncha mutantlari nerv naychalari nuqsonlari 44,45,46,47 va kraniofasiyal nuqsonlar48 bilan bog'liq.Nerv burmalari yoki faringeal yoylarda haddan tashqari ko'p hujayralar o'limi to'g'ri morfogenetik harakat uchun zarur bo'lgan hujayralar sonining etarli emasligiga olib kelishi mumkin 48,49,50.Bundan farqli o'laroq, o'rtacha darajada kamaygan SPECC1L ekspressiyasiga ega bo'lgan SPECC1L etishmovchiligi bo'lgan hujayra chiziqlarimiz hujayra o'limining kuchayishi isbotisiz faqat AJ o'zgarishlarini ko'rsatdi.Biroq, bu Kd hujayralarida PI3K-AKT yo'lining kimyoviy inhibisyonu apoptozning kuchayishiga olib keldi.Shunday qilib, SPECC1L ifodasi yoki funktsiyasining o'rtacha pasayishi hujayraning omon qolishini ta'minlaydi.Bu nodir Specc11 mutant embrionlarining st.E9.5 - ehtimol genlarni ushlash samaradorligi pasayganligi sababli - nerv naychalarini yopish va keyinchalik rivojlanishda to'xtab qolish, ko'pincha kraniofasiyal nuqsonlar (S3-rasm).Shuningdek, kraniofasiyal anomaliyalari bo'lgan heterozigot Specc1l embrionlarining kamdan-kam uchraydigan hodisasi - ehtimol genlarni ushlash samaradorligi oshishi bilan bog'liq - shuningdek, zebra baliqlarida SPECC1L ikkita ortologidan biri (specc1lb) kech embrion fenotiplarini yo'qotishiga olib keladi. pastki jag'lar va ikki tomonlama yoriqlar51.Shunday qilib, inson bemorlarida aniqlangan heterozigotli SPECC1L funktsiyani yo'qotish mutatsiyalari kraniofasiyal morfogenez paytida SPECC1L funktsiyasida kichik buzilishlarga olib kelishi mumkin, bu ularning orofasial yoriqlarini tushuntirish uchun etarli.SPECC1L asosidagi hujayralararo aloqalarni tartibga solish, shuningdek, faringeal yoylarning palatogenez va birlashishida ham rol o'ynashi mumkin.SPECC1L funktsiyasining keyingi tadqiqotlari neyroepitelial hujayralar harakatchanligi va kraniofasiyal morfogenezda neyron naychani yopish paytida CNCCda vaqtinchalik hujayralararo kontaktlarning rolini aniqlashga yordam beradi.
U2OS osteosarkomasi nazorati va SPECC1L-kd hujayralari ilgari tasvirlangan (Saadi va boshq., 2011).SPECC1L ga qarshi antikorlar ilgari ham tavsiflangan (Saadi va boshq., 2011).Anti-b-katenin antikorlari (quyon; 1: 1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (sichqoncha; 1: 1000; Hujayra signalizatsiya texnologiyasi, Danvers, MA), miyozin IIb (1: 1000; Sigma-Aldrich, Sent-Luis ), MO) ), E-kaderin (1:1000; Abkam, Kembrij, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Kolo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San-Diego) , Kaliforniya), DLX2 (1:1000; Abcam, Kembrij, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Hujayra signalizatsiya texnologiyasi, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1: 1000; Hujayra signalizatsiya texnologiyasi, Danvers, MA), 3-kaspaza (1: 1000; Hujayra signalizatsiya texnologiyasi, Danvers, MA) va b-aktin (1: 2500; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO ) tasvirlanganidek ishlatilgan..Aktin filamentlari Acti-stain rodamin phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Kolorado) bilan bo'yalgan.
U2OS boshqaruv hujayralari va SPECC1L-kd hujayralari 10% homila sigir zardobi (Life Technologies, Carlsbad, CA) bilan to'ldirilgan standart yuqori glyukoza DMEMda yetishtirildi.AJ o'zgarishlari uchun 2 x 105 hujayra 0,1% cho'chqa jelatini (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO) bilan ishlangan shisha ustiga ekilgan va hujayra shaklidagi o'zgarishlar kuzatilgan.Hujayralar turli xil ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida to'plangan: ekishdan 4 soat o'tgach (t = 1), ekishdan 24 soat keyin (t = 2), hujayra shaklida o'zgarishsiz qo'shilish (t = 3), hujayra shaklidagi o'zgarish (t = 4) , hujayra shakli o'zgargandan 24 soat keyin (t = 5) va hujayra shakli o'zgargandan 48 soat keyin (t = 6) (1, 2, 3-rasm).PI3K-AKT yo'lini modulyatsiya qilish uchun hujayralar PI3K-AKT inhibitori wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) yoki SC-79 faollashtiruvchisi (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota) bilan ko'rsatilgan konsentratsiyalarda o'stirildi.Kimyoviy moddalarni o'z ichiga olgan vosita har kuni o'zgartirildi.
Oddiy madaniyat sharoitida jonli nazorat va KD xujayralarida kadrma-kadr yozuvlari amalga oshirildi va fazali kontrastli tasvirlar 7 kun davomida har 10 daqiqada yig'ildi.Tasvirlar mexanik bosqich va QImaging Retiga-SRV kamerasiga ulangan 10 × N-PLAN ob'ektivi bilan jihozlangan kompyuter tomonidan boshqariladigan Leica DM IRB teskari mikroskop yordamida olingan.Tasvirlash vaqtida hujayra madaniyati 5% CO2 bo'lgan nam atmosferada 37 ° C da saqlanadi.
Mintaqaviy mutant sichqoncha resurs markazidan (UC Davis, CA) ikkita gen tuzog'i ES hujayra liniyalari DTM096 va RRH048 Specc11lgtDTM096 va Specc1lgtRRH046 deb nomlangan Specc11 nuqsonli sichqoncha chiziqlarini yaratish uchun ishlatilgan.Qisqacha aytganda, 129/REJ ES hujayralari C57BL6 blastotsistlariga AOK qilingan.Natijada paydo bo'lgan kimerik erkak sichqonlar Aguti paltosining rangi bo'lgan nasllarni aniqlash uchun urg'ochi C57BL6 sichqonlari bilan ko'paytirildi.Geterozigotalarni aniqlash uchun gen tuzog'i vektor qo'shimchalarining mavjudligi ishlatilgan.Sichqoncha 129/REJ;C57BL6 aralash fonida saqlangan.Genetik tuzoq vektorini kiritish joyining joylashuvi RT-PCR, genom ketma-ketligi va genetik komplementatsiya bilan tasdiqlangan (qo'shimcha 1-rasm).Ikki heterozigotli Specc1lGT sichqonlarining CNCC nasl-nasabini kuzatish uchun ROSAmTmG (#007576) va Wnt1-Cre (#003829) sichqonlari (Jekson Laboratoriyasi, Bar Harbor, ME) ROSAmTmG va Wnt1-Cre mutatsion allelini ishlab chiqarish uchun kesib o'tildi.Sichqonlardagi barcha tajribalar Kanzas tibbiyot markazi universitetining hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan protokollarga muvofiq amalga oshirildi.
Embrionlar (1% formaldegid, 0,2% glutaraldegid, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) xona haroratida 60 daqiqa davomida mahkamlangan.X-gal bo'yash eritmasida (5 mM kaliy ferrisiyanid, 5 mM kaliy ferrosiyanid, 2 mM MgCl2, 0,01% natriy deoksixolat, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) mahkamlangandan so'ng, dog '37 ° C da amalga oshirildi. .°C 1-6 soat ichida.Embrionlar 4% PFAda keyin o'rnatildi va vizualizatsiya qilindi.
Western blotting uchun hujayralar HALT proteaz inhibitörleri (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO) aralashmasi bilan to'ldirilgan passiv lizis tamponida (Promega, Fitchburg, WI) lizing qilindi.Lizatlar 12% poliakrilamid Mini-PROTEAN TGX tayyor jellarida (Bio-Rad, Hercules, CA) qayta ishlandi va Immobilon PVDF membranalariga (EMD Millipore, Billerica, MA) o'tkazildi.Membranalar 0,1% Tween o'z ichiga olgan PBSdagi 5% sutda bloklangan.Antikorlar kechasi 4 ° C da yoki xona haroratida bir soat davomida inkubatsiya qilindi.Signal ishlab chiqarish uchun Femto SuperSignal West ECL reaktivi (Thermo Scientific, Waltham, MA) ishlatilgan.Immunitetni bo'yash uchun embrionlar bir kechada 4% PFA/PBS da o'rnatildi va kriyokonservalanadi.To'qimalarning kriyoseksiyalari 1% normal echki zardobida (Thermo Scientific, Waltham, MA) va 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO) o'z ichiga olgan PBSda bloklandi va keyin inkubatorda 4 ° C da inkubatsiya davrida inkubatsiya qilindi. tun.antikor va floresan ikkilamchi antikor (1:1000) bilan 1 soat davomida 4 ° C da.Bo'yalgan qismlar ProLong oltin muhitiga (Thermo Scientific, Waltham MA) joylashtirildi va Leica TCS SPE konfokal mikroskopi yordamida tekis tasvirlar olindi.Har bir immuno-bo'yash kamida ikkita mutant embrionning cirossektsiyalarida uchta mustaqil tajriba sifatida amalga oshirildi.Vakolatli tajriba ko'rsatilgan.
Hujayralar o'zgartirilgan RIPA buferida (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glitserin, 2 mM EDTA va HALT proteaz inhibitori (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO) inkubatsiya qilindi. Qisqacha aytganda, lizatlar protein G magnit boncuklari (Life Technologies, Carlsbad, CA) bilan oldindan tozalangan va keyin 4 ° C da bir kechada inkubatsiya qilingan. Anti-SPECC1L yoki IgG protein G protein boncuklari bilan SPECC1L ekstrakti ishlatilgan va anti-bloklash yordamida Western blotting amalga oshirilgan. Yuqorida tavsiflangan -b-katenin antikorlari Ko'rsatilgan ko-IP tajribalari to'rtta mustaqil tajribani ifodalaydi.
Ruxsat etilgan madaniyatli hujayralar yoki sichqonchaning embrion to'qimalari Kanzas universiteti tibbiyot markazidagi elektron mikroskopiya markaziga taqdim etildi.Qisqacha aytganda, namunalar EMbed 812 qatroniga (Elektron Mikroskopiya fanlari, Fort Vashington, Pensilvanya) o'rnatilgan, 60 ° C da bir kechada polimerlangan va olmos pichoq bilan jihozlangan Leica UC7 ultramikrotomi yordamida 80 nm da bo'lingan.Bo'limlar 100 kV Lab6 avtomati bilan jihozlangan JEOL JEM-1400 transmissiya elektron mikroskopi yordamida tasvirlangan.
Ushbu maqolani qanday keltirish mumkin: Wilson, NR va boshqalar.SPECC1L etishmovchiligi qo'shilgan bo'g'inlarning barqarorligini oshirishga va kranial asab hujayralarining delaminatsiyasini pasayishiga olib keladi.fan.6, 17735;doi: 10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Nerv tolasining induksiyasi va differentsiatsiyasi.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR va boshqalar.Harakatdagi kranial asab hujayralari: ularning kraniofasiyal rivojlanishidagi roli.Amerika tibbiy genetika jurnali.A qismi 155A, 270–279, doi: 10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neyrokristopatiya: uning 20 yil davomida o'sishi va rivojlanishi.Pediatr.patologiya.laboratoriya.dori.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU va Noten MM. Orofasiyal yoriqlar genetikasidagi yutuq.Molekulyar tibbiyotdagi tendentsiyalar 17, 725-733, doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. va Riley, FM. Kraniyofasiyal rivojlanish davrida kranial nerv tepasi hujayralarining ko'chishi va naqshlarining molekulyar mexanizmlari.Rivojlanish 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH va Murray, JK Yoriq lab va tanglay: genetik va atrof-muhit ta'sirini tushunish.tabiiy izoh.Genetika 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR va boshqalar.Interferonni tartibga soluvchi omil-6 (Irf6) etishmovchiligi bo'lgan sichqonlarda terining, oyoq-qo'llarning va kraniofasiyal mintaqaning anormal morfogenezi.Milliy Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. va boshqalar.GRHL3 dagi dominant mutatsiyalar van der Waord sindromini keltirib chiqaradi va og'iz peridermasining rivojlanishiga putur etkazadi.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Xarris, MJ va Juriloff, DM Nerv naychasining yopilishida nuqsonlari bo'lgan sichqoncha mutantlari ro'yxatini yangilang va asab naychasining yopilishini to'liq genetik tushunishga erishing.Tug'ma nuqsonlarni tekshirish.A qism, Klinik va molekulyar teratologiya 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K vositachiligidagi PDGFRalpha signalizatsiyasi p53 ga bog'liq hujayra ichidagi yo'l orqali skelet rivojlanishida omon qolish va ko'payishni tartibga soladi.Gen rivojlanishi 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND va Murdoch, JN Dishveled: konvergent kengayishning asab naychasining yopilishiga aloqasi.Nevrologiyadagi tendentsiyalar.26, 453–455, doi: 10.1016 / S0166-2236 (03) 00212-1 (2003).