347 12,7 * 1,24 mm zanglamaydigan po'latdan yasalgan o'ralgan quvurlar, a-sinuklein va tau ning sinxron elektrostatik kondensatsiyasi va koaggregatsiyasining molekulyar mexanizmi

Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydigan brauzer versiyasidan foydalanmoqdasiz.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptlarsiz ko'rsatamiz.
Har bir slaydda uchta maqolani ko'rsatadigan slayderlar.Slaydlar boʻylab harakatlanish uchun “Orqaga” va “Keyingi” tugmalaridan yoki har bir slayd boʻylab harakatlanish uchun oxiridagi slaydni boshqarish tugmalaridan foydalaning.

347 zanglamaydigan po'lat quvur spetsifikatsiyasi

347 12,7 * 1,24 mm zanglamaydigan po'latdan o'ralgan quvurlar

Tashqi diametri: 6.00 mm OD dan 914.4 mm gacha, oʻlchamlari 24” NB gacha mavjud.

SS 347 Quvur qalinligi diapazoni: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S va boshqalar (0,5-12 mm) Yoki nostandart o'lchamlar kerak bo'lganda moslashtiriladi

Turi: SS 347 choksiz quvurlar |SS 347 ERW quvurlari |SS 347 Payvandlangan quvurlar |SS 347 ishlab chiqarilgan quvurlar |SS 347 CDW quvurlari, LSAW quvurlari / payvandlangan / qayta chizilgan

Shakl: SS 347 dumaloq quvurlar/naychalar, SS 347 kvadrat quvurlar/naychalar, SS 347 to‘rtburchaklar quvur/naychalar, SS 347 o‘ralgan quvurlar, SS 347 “U” shakli, SS 347 pan kek rulonlari, SS 347 gidravlik quvurlar

Uzunlik: bitta tasodifiy, ikki marta tasodifiy va talab qilinadigan uzunlik uchi: tekis uchi, qirrali uchi, bosilgan uchi

Oxirgi himoya: Plastik qopqoqlar |Tashqi pardozlash: 2B, №4, №1, №8 zanglamaydigan po'lat quvurlar uchun oyna qoplamasi, mijozning talablariga muvofiq tugatish

Yetkazib berish holati: tavlangan va tuzlangan, sayqallangan, yorqin tavlangan, sovuq tortilgan

Tekshiruv, sinov hisobotlari: tegirmon sinovlari sertifikatlari, EN 10204 3.1, kimyoviy hisobotlar, mexanik hisobotlar, PMI sinov hisobotlari, vizual tekshirish hisobotlari, uchinchi tomon tekshiruv hisobotlari, NABL tomonidan tasdiqlangan laboratoriya hisobotlari, vayron qiluvchi sinov hisoboti, buzilmaydigan sinov hisoboti

Qadoqlash: yog'och qutilarga, plastik qoplarga, po'lat chiziqlarga yoki mijozlar talabiga binoan qadoqlangan

Maxsus xususiyatlar: Yuqoridagilardan boshqa o'lchamlar va texnik xususiyatlar so'rov bo'yicha ishlab chiqarilishi mumkin

SS 347 quvur o'lchami diapazoni: 1/2 dyuymli NB, OD dan 24 dyuymgacha

ASTM A312 347: Choksiz va tekis tikuvli payvandlangan ostenitik quvur yuqori harorat va umumiy korroziy xizmat ko'rsatish uchun mo'ljallangan.Payvandlash vaqtida to'ldiruvchi metallga ruxsat berilmaydi.

ASTM A358 347: Korroziv va/yoki yuqori haroratli xizmat ko'rsatish uchun elektr termoyadroviy payvandlangan ostenitik quvur.Odatda bu spetsifikatsiyaga faqat 8 dyuymgacha bo'lgan quvur ishlab chiqariladi.Payvandlash vaqtida plomba metallini qo'shishga ruxsat beriladi.

ASTM A790 347: Choksiz va to'g'ri tikuvli payvandlangan ferrit / austenit (dupleks) quvur umumiy korroziyaga qarshi xizmat ko'rsatish uchun mo'ljallangan, ayniqsa stressli korroziya yorilishiga qarshilik ko'rsatadi.

ASTM A409 347: To'g'ridan-to'g'ri tikuv yoki spiral tikuvli elektr termoyadroviy payvandlangan katta diametrli ostenitik yorug'lik devori trubkasi 14 "dan 30" gacha o'lchamdagi devorlari Sch5S va Sch 10S bilan korroziy va / yoki yuqori.

ASTM A376 347: Yuqori haroratli ilovalar uchun choksiz ostenitik quvur.

ASTM A813 347: Yuqori harorat va umumiy korroziy ilovalar uchun bitta tikuvli, bitta yoki ikki marta payvandlangan ostenitik quvur.

ASTM A814 347: Yuqori harorat va umumiy korroziv xizmat uchun sovuq ishlov berilgan payvandlangan ostenitik quvur.

347H zanglamaydigan po'lat quvurlar kimyoviy tarkibi

Zanglamaydigan po'latdan 347H quvur mexanik xususiyatlari

Zanglamaydigan po'latdan yasalgan 347H quvurlari jismoniy xususiyatlari

347H zanglamaydigan po'lat quvur uchun ekvivalent baholar

Amiloid alfa-sinuklein (aS) agregatsiyasi Parkinson kasalligi va boshqa sinukleinopatiyalarning o'ziga xos belgisidir.So'nggi paytlarda tez-tez Altsgeymer kasalligi bilan bog'liq bo'lgan tau oqsili aS patologiyasi bilan bog'liq bo'lib, aS ga boy qo'shimchalarda birgalikda joylashishi aniqlandi, ammo ikkita oqsilning koagregatsiyasining molekulyar mexanizmi noaniq bo'lib qolmoqda.Biz bu erda xabar beramizki, aS fazasi tau kabi musbat zaryadlangan polipeptidlar bilan elektrostatik kompleks kondensatsiya orqali suyuq kondensatlarga ajraladi.aS ning polikationlarga yaqinligi va koagulyatsion tarmoqning valentlik pasayish tezligiga qarab, pıhtılar tez gellanish yoki koalessensiyaga uchraydi, so'ngra sekin amiloid agregatsiyasi kuzatiladi.Ilg'or biofizikaviy texnikalar to'plamini birlashtirib, biz suyuqlik-suyuqlik aS/Tau fazasini ajratishni tavsiflash va suyuq oqsil kondensatida ikkala oqsilni o'z ichiga olgan heterojen agregatlarning shakllanishiga olib keladigan asosiy omillarni aniqlashga muvaffaq bo'ldik.
Membran bo'linmalariga qo'shimcha ravishda hujayralardagi fazoviy ajralish suyuqlik-suyuqlik fazasini ajratish (LLPS) deb nomlanuvchi jarayon orqali biomolekulyar kondensat yoki tomchilar deb ataladigan oqsilga boy, suyuqlikka o'xshash zich jismlarning shakllanishi orqali ham amalga oshirilishi mumkin.Bu tomchilar odatda oqsillar yoki oqsillar va RNK o'rtasidagi ko'p valentli vaqtinchalik o'zaro ta'sirlar natijasida hosil bo'ladi va deyarli barcha tirik tizimlarda turli funktsiyalarni bajaradi.Ko'p miqdordagi LLP qobiliyatiga ega bo'lgan oqsillar tabiatda va biomolekulyar kondensatlarning shakllanishida juda tartibsiz bo'lgan past murakkablikdagi ketma-ketlikni namoyish etadi3,4,5.Ko'pgina eksperimental tadqiqotlar suyuqlikka o'xshash kondensatlarni tashkil etuvchi oqsillarning moslashuvchan, ko'pincha tartibsiz va ko'p valentli tabiatini aniqladi, ammo bu kondensatlarning o'sishi va pishib etilishini boshqaradigan o'ziga xos molekulyar determinantlar haqida juda kam narsa ma'lum. davlat..
Yangi ma'lumotlar g'ayritabiiy oqsil bilan boshqariladigan LLPS va tomchilarning qattiq tuzilmalarga aylanishi ko'pincha degenerativ kasalliklarning belgilari bo'lgan erimaydigan toksik agregatlarning shakllanishiga olib keladigan tegishli hujayra yo'llari bo'lishi mumkinligi haqidagi farazni qo'llab-quvvatlaydi.Ko'pincha LLPS bilan bog'liq bo'lgan ichki tartibsiz oqsillar (IDP), ko'pincha yuqori zaryadlangan va moslashuvchan, uzoq vaqt davomida amiloid agregatsiyasi jarayoni orqali neyrodegeneratsiya bilan bog'liq.Xususan, FUS7 yoki TDP-438 kabi biomolekulyar IDP kondensatlari yoki hnRNPA19 kabi katta murakkablik darajasi past bo'lgan oqsillar suyuqlik deb ataladigan jarayon orqali jelga o'xshash yoki hatto qattiq shakllarga qarishi ko'rsatilgan.birikma.Qattiq fazaga o'tish (LSPT) vaqt funktsiyasi sifatida yoki ma'lum post-translatsion modifikatsiyalarga yoki patologik ahamiyatga ega mutatsiyalarga javoban1,7.
In vivo LLPS bilan bog'liq bo'lgan yana bir IDP - bu Tau, mikronaychalar bilan bog'liq bo'lgan tartibsiz oqsil, uning amiloid agregatsiyasi Altsgeymer kasalligi10 bilan bog'liq, ammo yaqinda Parkinson kasalligi (PD) va boshqa sinaptik yadroviy proteinopatiyalar 11, 12, 13 bilan bog'liq.Tau qulay elektrostatik o'zaro ta'sirlar14 tufayli eritma/sitoplazmadan o'z-o'zidan ajralishi ko'rsatilgan, buning natijasida elektrostatik koaservatlar deb nomlanuvchi tau bilan boyitilgan tomchilar hosil bo'ladi.Shuningdek, bu turdagi o'ziga xos bo'lmagan o'zaro ta'sir tabiatdagi ko'plab biomolekulyar kondensatlarning harakatlantiruvchi kuchi ekanligi aniqlangan15.Tau oqsili bo'lsa, elektrostatik agregatsiya oddiy agregatsiya yo'li bilan hosil bo'lishi mumkin, bunda oqsilning qarama-qarshi zaryadlangan hududlari parchalanish jarayonini qo'zg'atadi yoki RNK kabi manfiy zaryadlangan polimerlar bilan o'zaro ta'sir qilish orqali murakkab agregatsiya yo'li bilan hosil bo'lishi mumkin.
Yaqinda a-sinuklein (aS), PD va boshqa neyrodejenerativ kasalliklar bilan bog'liq bo'lgan amiloid IDP, birgalikda sinukleinopatiya17,18 deb nomlanuvchi, suyuqlikka o'xshash xatti-harakatlarga ega bo'lgan oqsil kondensatlarida to'plangan hujayra va hayvonlar modellarida 19,20 namoyish etilgan.In vitro tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, aS asosan hidrofobik o'zaro ta'sirlar orqali oddiy agregatsiya orqali LLPSga duchor bo'ladi, ammo bu jarayon juda yuqori protein konsentratsiyasini va atipik uzoq inkubatsiya vaqtlarini talab qiladi19,21.Vivo jonli ravishda kuzatilgan aS o'z ichiga olgan kondensatlarning bu yoki boshqa LLPS jarayonlari natijasida hosil bo'lishi hal qilinmagan asosiy muammo bo'lib qolmoqda.Xuddi shunday, aS amiloid agregatsiyasi PD va boshqa sinukleinopatiyalarda neyronlarda kuzatilgan bo'lsa-da, aS ning hujayra ichidagi amiloid agregatsiyasidan o'tishining aniq mexanizmi noaniqligicha qolmoqda, chunki bu oqsilning haddan tashqari ifodalanishi bu jarayonni o'z-o'zidan qo'zg'atmaydi.Ko'pincha qo'shimcha hujayra shikastlanishi talab qilinadi, bu hujayra ichidagi aS amiloid birikmalarining renukleatsiyasi uchun ma'lum hujayrali joylar yoki mikro muhitlar zarurligini ko'rsatadi.Agregatsiyaga ayniqsa moyil bo'lgan hujayrali muhitlardan biri oqsil kondensatlarining ichki qismi bo'lishi mumkin 23 .
Qizig'i shundaki, aS va tau Parkinson kasalligi va boshqa sinukleinopatiyalari bo'lgan odamlarda xarakterli kasallik inklyuziyalarida birgalikda joylashishi aniqlangan 24,25 va tajribalar ikkita oqsil o'rtasida sinergik patologik munosabatlar haqida xabar bergan 26,27 aS va tau agregatsiyasi o'rtasidagi potentsial aloqani ko'rsatmoqda. neyrodegenerativ kasalliklarda tau.kasallik.aS va tau bir-birining agregatsiyasini in vitro va in vivo 28,29 bilan o'zaro ta'sir qilishi va rag'batlantirishi aniqlangan va bu ikki oqsildan tashkil topgan heterojen agregatlar 30 sinukleinopatiyali bemorlarning miyasida kuzatilgan.Biroq, aS va tau o'rtasidagi o'zaro ta'sirning molekulyar asoslari va uning birgalikda agregatsiya mexanizmi haqida juda kam narsa ma'lum.aS ning tau bilan yuqori manfiy zaryadlangan C-terminal hududi va musbat zaryadlangan qoldiqlar bilan boyitilgan markaziy prolinga boy tau mintaqasi o'rtasidagi elektrostatik tortishish orqali ta'sir o'tkazishi haqida xabar berilgan.
Ushbu tadqiqotda biz poli-L-lizin (pLK) kabi boshqa musbat zaryadlangan polipeptidlar bilan o'zaro ta'siridan farqli o'laroq, aS tau oqsili ishtirokida elektrostatik kompleks kondensatsiya orqali tomchilarga ajralishi mumkinligini ko'rsatamiz va bu jarayonda.aS tomchilar tarmog'i uchun iskala molekulasi vazifasini bajaradi.Biz elektrostatik aS koaservatlarining etilish jarayonida sezilarli farqlarni aniqladik, bu koaservatlar tarmog'ida ishtirok etadigan oqsillarning o'zaro ta'sirining valentligi va kuchidagi farqlar bilan bog'liq.Qizig'i shundaki, biz uzoq muddatli suyuqlik koaservatlarida aS va tau amiloid oqsillarining birgalikda agregatsiyasini kuzatdik va bunday koaservatlarda bu ikki oqsilning birgalikda agregatsiyasiga olib keladigan ba'zi asosiy omillarni aniqladik.Bu erda biz ushbu jarayonni batafsil tasvirlab beramiz, bu kasallikning o'ziga xos inklyuziyalarida ikkita oqsilning kolokalizatsiyasi asosida yotadigan mumkin bo'lgan molekulyar mexanizmdir.
aS neytral pHda yuqori anionli C-terminal dumiga ega (1a-rasm) va biz u polikatyonik tartibsiz polipeptid molekulalari bilan elektrostatik komplekslarning kondensatsiyasi orqali LLPSga o'tishi mumkinligini taxmin qildik.Neytral pH 32 da musbat zaryadlangan va tartibsiz polimerik tabiati tufayli biz boshlang‘ich model molekulasi sifatida 100 qoldiqli poli-L-lizin (pLK) dan foydalandik. Birinchidan, pLK eritma NMR spektroskopiyasi orqali aS ning Ct sohasi bilan o‘zaro ta’sir qilishini tasdiqladik. (1b-rasm) ortib borayotgan aS: pLK molyar nisbati mavjudligida 13C/15N etiketli aS yordamida.pLK ning aS ning Ct-domeni bilan o'zaro ta'siri kimyoviy siljishning buzilishlarida va oqsilning ushbu hududida eng yuqori intensivligining pasayishida namoyon bo'ladi.Qizig'i shundaki, biz aS ni pLK bilan taxminan aS konsentratsiyasida aralashtirganda.Polietilen glikol (5-15% PEG-8) ishtirokida 5-25 mkM (odatiy LLPS buferi: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) biz darhol oqsil hosil bo'lishining keng maydonidan o'tdik. .tomchilar floresan (WF) va yorqin maydon (BF) mikroskop yordamida kuzatilgan (1c-rasm).Konsentrlangan aS ni o'z ichiga olgan 1-5 mkm tomchilar (qo'shilgan 1 mkM AlexaFluor488 etiketli aS, AF488-aS), ularning elektrostatik xususiyatlari 10% 1,6-geksandiolga (1,6-HD) qarshilik va uning sezgirligidan kelib chiqishi mumkin. NaCl kontsentratsiyasining oshishi (1c-rasm).aS/pLK elektrostatik kompleksining koaservatlarining suyuqlikka o'xshash tabiati ularning millisekundlarda birlasha olish qobiliyati bilan namoyon bo'ladi (1d-rasm).Turbidimetriya yordamida biz ushbu sharoitlarda tomchilar hosil bo'lishini miqdoriy jihatdan aniqladik, uning barqarorligi bilan bog'liq bo'lgan asosiy o'zaro ta'sirning elektrostatik xususiyatini tasdiqladik (1e-rasm) va turli polimer nisbatlarining LLPS jarayoniga ta'sirini baholadik (1f-rasm).Tomchilarning hosil bo'lishi polimer nisbatlarining keng diapazonida kuzatilgan bo'lsa-da, pLK aS dan ortiq bo'lsa, jarayon juda qulaydir.MChJlar kimyoviy jihatdan farq qiluvchi dekstran-70 (70 kDa) yoki turli xil namuna formatlari, jumladan, shisha slayd tomchilari, turli materiallardan mikroplyonka quduqlari, Eppendorf yoki kvarts kapillyarlari yordamida ham kuzatilgan.
Ushbu tadqiqotda foydalanilgan WT-aS va DCt-aS variantlarida turli xil oqsil mintaqalarining sxematik tasviri.Amfipatik N-terminal domeni, hidrofobik amiloid hosil qiluvchi hudud (NAC) va manfiy zaryadlangan C-terminal domeni mos ravishda ko'k, to'q sariq va qizil ranglarda ko'rsatilgan.WT-aS ning Net Charge Per Residual (NCPR) xaritasi ko'rsatilgan.b Makromolekulyar bo'laklar bo'lmaganda aS / pLK o'zaro ta'sirining NMR tahlili.pLK kontsentratsiyasining oshishi bilan (aS: pLK molar nisbati 1:0,5, 1:1,5 va 1:10 mos ravishda och yashil, yashil va quyuq yashil rangda ko'rsatilgan).c LLPS buferida (yuqorida) yoki 500 mM NaCl yoki undan keyin (pastda 10) qo‘shilgan aS/pLK (molyar nisbat 1:10) ni 25 mkM (WF tasviri uchun 1 mkM AF488-yorliqli aS yoki Atto647N etiketli pLK) da koaservatlash % 1,6-geksandiol (1,6-HD; pastki o'ng).O'lchov paneli = 20 mikron.d 25 mkM konsentratsiyada aS / pLK (molyar nisbati 1:10) ning BF tomchilari sintezining vakili mikroskopik tasvirlari;o'qlar alohida tomchilarning (qizil va sariq o'qlar) yangi tomchiga (to'q sariq o'q) 200 ms ichida birlashishini ko'rsatadi).O'lchov paneli = 20 mikron.e 500 mM NaCl yoki 25 mM aS da 10% 1,6-HD qo'shilishidan oldin va keyin LLPS buferida yorug'likning tarqalishi (350 nm da) aS/pLK agregatsiyasi (N = 3 ta namuna replikatsiyasi, o'rtacha va standart og'ish ham ko'rsatilgan).f BF tasviri (yuqorida) va yorug'lik tarqalishi tahlili (350 nm, pastki qismida) aS / pLK agregatsiyasining 25 mM aS da aS: pLK molyar nisbati ortib borishi bilan (N = 3 namuna replikatsiyasi, o'rtacha va standart og'ish ham ko'rsatilgan).O'lchov paneli = 10 mikron.Bitta rasmdagi masshtab paneli bitta paneldagi barcha tasvirlarning masshtabini bildiradi.Xom ma'lumotlar xom ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.
aS/pLK elektrostatik kompleks kondensatsiyasini kuzatishlarimiz va tau31 bilan to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sir qilish orqali tau / RNK kondensatining mijoz molekulasi sifatida aS ning oldingi kuzatuvlariga asoslanib, biz RNK yo'qligida aS va tau erituvchi bilan birgalikda ajralishi mumkinligini taxmin qildik. kondensatsiya.elektrostatik komplekslar orqali va aS aS/Tau koaservatlaridagi iskala oqsilidir (2e-rasmdagi tau zaryadining taqsimlanishiga qarang).LLPS buferida 10 mkM aS va 10 mkM Tau441 (mos ravishda 1 mkM AF488-aS va 1 mkM Atto647N-Tau) aralashtirilganda, ular WF mikroskopida ko'rinib turganidek, ikkala oqsilni ham o'z ichiga olgan oqsil agregatlarini osongina hosil qilishini kuzatdik.(2a-rasm).Tomchilardagi ikkita oqsilning kolokalizatsiyasi konfokal (CF) mikroskopiya bilan tasdiqlangan (Qo'shimcha rasm. 1a).Shunga o'xshash xatti-harakatlar dekstran-70 agregatsiya vositasi sifatida ishlatilganda ham kuzatildi (qo'shimcha 1c-rasm).FITC etiketli PEG yoki dekstrandan foydalanib, biz ikkala to'plash agenti ham namunalar bo'ylab teng taqsimlanganligini aniqladik, ular na segregatsiyani, na assotsiatsiyani ko'rsatmaydi (Qo'shimcha rasm. 1d).Aksincha, bu tizimda ular makromolekulyar to'planish effektlari orqali fazalarni ajratishni rag'batlantiradilar, chunki PEG boshqa LLP tizimlarida ko'rinib turganidek, barqaror to'planish agenti hisoblanadi33,34.Bu oqsilga boy tomchilar NaCl (1 M) ga sezgir edi, lekin 1,6-HD (10% v/v) ga emas, bu ularning elektrostatik xususiyatlarini tasdiqlaydi (Qo'shimcha rasm 2a, b).Ularning suyuqlik harakati BF mikroskopidan foydalangan holda millisekundlik birlashuvchi tomchi hodisalarini kuzatish orqali tasdiqlandi (2b-rasm).
LLPS buferidagi aS/Tau441 koaservatlarining konfokal (CF) mikroskop tasvirlari (har bir oqsildan 10 mkM, AF488 etiketli aS va Atto647N etiketli Tau441 dan 0,5 mkm).b aS/Tau441 tomchilari sintezi hodisalarining vakillik differentsial shovqin kontrastli (DIC) tasvirlari (har bir oqsil uchun 10 mkM).c Tau441 LLPS (0–15 µM) ning 50 µM aS yo‘qligida (chapda) yoki mavjudligida (o‘ngda) yorug‘lik tarqalishiga (350 nm da) asoslangan faza diagrammasi.Issiq ranglar ko'proq tarqalishni ko'rsatadi.d aS/Tau441 LLPS namunalarining aS kontsentratsiyasi ortishi bilan yorug'likning tarqalishi (5 µM da Tau441, ko'rsatilgandek N = 2-3 namuna takrori).e Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan ba'zi tau oqsili variantlari va oqsilning turli mintaqalarining sxematik tasviri: manfiy zaryadlangan N-terminal domen (qizil), prolinga boy mintaqa (ko'k), mikrotubulalar bilan bog'lovchi domen (MTBD, to'q sariq rang bilan belgilangan) va amiloid hosil qiluvchi juft spiral.MTBD (kulrang) ichida joylashgan filament hududlari (PHF).Tau441 ning Net Charge Per Residue (NCPR) xaritasi ko'rsatilgan.f DNt-Tau (yuqorida, har bir oqsil uchun 10 µM) yoki K18 (pastki, har bir protein uchun 10 µM) mavjud bo‘lganda, 1 mkM AF488 etiketli aS va Atto647N etiketli DNt-, 1 mkM AF488 etiketli aS yoki DCt-aS yordamida )) ) LLPS yoki K18 buferida kondensatsiyalangan WF ning mikrograflari.Bitta rasmdagi masshtab chiziqlari bitta paneldagi barcha tasvirlar masshtabini ifodalaydi (a, b va f panellari uchun 20 mkm).c va d panellari uchun xom ma'lumotlar xom ma'lumotlar fayllari sifatida taqdim etiladi.
Ushbu LLPS jarayonida aS ning rolini sinab ko'rish uchun biz birinchi navbatda NaCl ning ortib borayotgan kontsentratsiyasidan foydalangan holda aS ning tomchilar barqarorligiga ta'sirini nefelometriya orqali tekshirdik (2c-rasm).aS ni o'z ichiga olgan namunalardagi tuz konsentratsiyasi qanchalik yuqori bo'lsa, yorug'lik tarqalish qiymatlari shunchalik yuqori bo'ladi (350 nm da), bu aS ning ushbu LLPS tizimidagi barqarorlashtiruvchi rolini ko'rsatadi.Shunga o'xshash ta'sir aS kontsentratsiyasini (va shuning uchun aS: Tau441 nisbati) taxminan oshirish orqali kuzatilishi mumkin.Tau kontsentratsiyasiga nisbatan 10 baravar ortish (5 µM) (2d-rasm).aS ning koaservatlarda iskala oqsili ekanligini ko'rsatish uchun biz DNt-Tau deb ataladigan manfiy zaryadlangan N-terminal hududiga (qoldiqlar 1-150, 2e-rasmga qarang) ega bo'lmagan LLPS-buzilgan Tau mutantining xatti-harakatlarini tekshirishga qaror qildik.WF mikroskopiyasi va nefelometriyasi DNt-Tauning o'zi LLPSdan o'tmaganligini tasdiqladi (2f-rasm va qo'shimcha rasm 2d), avval xabar qilinganidek 14. Biroq, bu kesilgan Tau variantining dispersiya eritmalariga aS qo'shilganda, LLPS jarayoni to'liq bo'lgan. shunga o'xshash sharoitlarda va oqsil kontsentratsiyasida Tau va aS ning to'liq o'lchamli eritmalarining tomchi zichligiga yaqin tomchi zichligi bilan tiklanadi.Bu jarayonni past makromolekulyar to'planish sharoitida ham kuzatish mumkin (Qo'shimcha 2c-rasm).LLPS jarayonida C-terminal aS hududining roli, lekin uning butun uzunligi emas, (DCt-) qoldiqlari 104-140 (1a-rasm) bo'lmagan C-terminal kesilgan aS varianti yordamida tomchilar hosil bo'lishini inhibe qilish orqali ko'rsatildi. aS) oqsili (2f-rasm va qo'shimcha 2d-rasm).aS va DNt-Tau ning kolokalizatsiyasi konfokal floresan mikroskopiya bilan tasdiqlangan (Qo'shimcha rasm. 1b).
Tau441 va aS o'rtasidagi LLPS mexanizmini qo'shimcha tekshirish uchun qo'shimcha Tau varianti, ya'ni mikronaychalarni bog'lovchi domendagi (MTBD) juftlangan spiral filament yadrosi (PHF) fragmenti ishlatilgan, agar u to'rtta xarakterli takroriy domenni o'z ichiga olgan bo'lsa, odatda ma'lum. K18 fragmenti sifatida (2e-rasmga qarang).Yaqinda ma'lum bo'lishicha, aS prolinga boy domenda joylashgan tau oqsili bilan mikronaychalarni bog'lovchi domendan oldingi ketma-ketlikda bog'lanadi.Shu bilan birga, PHF mintaqasi musbat zaryadlangan qoldiqlarga ham boy (2e-rasmga qarang), ayniqsa lizin (15% qoldiq), bu bizni ushbu hudud aS/Tau kompleksining kondensatsiyasiga ham hissa qo'shishini tekshirishga undadi.Biz K18ning o'zi sinovdan o'tgan sharoitlarda (15% PEG yoki 20% dekstranli LLPS buferi) 100 mkM gacha bo'lgan konsentratsiyalarda LLPSni ishga tushira olmasligini kuzatdik (2f-rasm).Biroq, biz 50 mkM aS ni 50 mkM K18 ga qo'shganimizda, nefelometriya (Qo'shimcha 2d-rasm) va WF mikroskopiyasi (2f-rasm) yordamida K18 va aS ni o'z ichiga olgan oqsil tomchilarining tez shakllanishi kuzatildi.Kutilganidek, DCt-aS K18 ning LLPS xatti-harakatlarini tiklay olmadi (2f-rasm).Shuni ta'kidlaymizki, aS / K18 agregatsiyasi aS / DNt-Tau yoki aS / Tau441 bilan solishtirganda LLPSni qo'zg'atish uchun biroz yuqoriroq protein konsentratsiyasini talab qiladi, boshqa narsalar tengdir.Bu ilgari 31 ta'riflanganidek, aS C-terminal mintaqasining prolinga boy Tau domeni bilan mikrotubulani bog'lovchi domen bilan solishtirganda kuchli o'zaro ta'siriga mos keladi.
DNt-Tau aS yo'qligida LLPSni bajara olmasligini hisobga olib, biz bu Tau variantini to'liq uzunlikdagi Tau (izotipi, Tau441/Tau441) bilan LLPS tizimlarida soddaligini hisobga olgan holda aS/Tau LLPSni tavsiflash uchun model sifatida tanladik.murakkab (heterotipik, aS/Tau441) agregatsiya jarayonlari bilan.Biz aS/Tau va aS/DNt-Tau tizimlarida aS agregatsiya darajasini (kondensatsiyalangan faza oqsilining bir qismi sifatida, faS,c) santrifüjlash va dispers fazali SDS-PAGE tahlili bilan solishtirdik (2e-ga qarang), juda o'xshash qiymatlarni topdik. bir xil konsentratsiyadagi barcha oqsillar uchun.Xususan, biz aS/Tau va aS/DNt-Tau uchun mos ravishda faS,c 84 ± 2% va 79 ± 7% ni oldik, bu aS va tau o'rtasidagi heterotipik o'zaro ta'sir tau molekulalari orasidagi o'zaro ta'sirdan ustun ekanligini ko'rsatdi.orasida.
Turli xil polikatyonlar bilan o'zaro ta'sir va kondensatsiya jarayonining aS kinetikasiga ta'siri birinchi marta fotooqartirish (FRAP) usulidan keyin floresansni tiklash bilan o'rganildi.Biz aS/Tau441, aS/DNt-Tau va aS/pLK koaservatlarini sinovdan o'tkazdik (100 mkM aS, 2 mkM aS AF488-aS va 100 mkM Tau441 yoki DNt-Tau yoki 1 mM pLaK bilan to'ldirilgan).Namuna komponentlarini aralashtirishdan keyin ma'lumotlar dastlabki 30 daqiqada olingan.Vakolatli FRAP tasvirlaridan (3a-rasm, aS/Tau441 kondensatsiyasi) va ularning tegishli vaqt kursi egri chiziqlaridan (3b-rasm, qo'shimcha rasm 3) aS kinetikasi Tau441 koaservatlarinikiga juda o'xshashligini ko'rish mumkin.va DNt-Tau, bu pLK bilan ancha tezroq.FRAP bo'yicha koaservat ichidagi aS uchun hisoblangan diffuziya koeffitsientlari (Kang va boshq. 35 tomonidan ta'riflanganidek) aS/Tau441 va aS/Tau441 uchun D = 0,013 ± 0,009 mkm2/s va D = 0,026 ± 0,008 mkm2/s. aS/ tizimi.pLK, Tau va D = 0,18 ± 0,04 mkm2/s mos ravishda (3c-rasm).Shu bilan birga, dispers fazadagi aS diffuziya koeffitsienti bir xil sharoitlarda (LLPS buferi), lekin polikasyonlar bo'lmaganda, floresan korrelyatsiya spektroskopiyasi (FCS, Qo'shimcha 3-rasmga qarang) tomonidan aniqlanganidek, barcha kondensatsiyalangan fazalardan bir necha daraja yuqoriroqdir. (D = 8 ± 4 mkm2/s).Shuning uchun aS translatsiya kinetikasi koaservatlarda dispers fazadagi oqsillarga nisbatan sezilarli darajada kamayadi, garchi barcha koaservatlar tau fazasidan farqli o'laroq, hosil bo'lganidan keyin birinchi yarim soat davomida suyuqlikka o'xshash xususiyatlarni saqlab qoladilar.pLK kondensatida tezroq kinetika.
Elektrostatik koaservatlarda aS dinamikasini (2% AF488 etiketli aS) a-c FRAP tahlili.aS/Tau441 FRAP tahlillarining uch nusxadagi vakillik tasvirlari (a) da ko'rsatilgan, bu erda qizil doiralar rangsizlangan joylarni ko'rsatadi.O'lchov paneli 5 mikron.b O'rtacha FRAP egri chiziqlari va (c) 100 mkM aS va Tau441 (qizil) yoki DNt-Tau (ko'k) yoki pLK (yashil) ekvimolyar kontsentratsiyasidan foydalangan holda uchta tajribadan olingan 5-6 (N) turli tomchilar uchun hisoblangan diffuziya koeffitsientlari (D) LLPS konsentratsiyasidan o'n baravar yuqori.FRAP egri chizig'ining standart og'ishi soyali rangda ko'rsatilgan.Taqqoslash uchun dispers fazadagi diffuziya koeffitsienti aS floresans korrelyatsiya spektroskopiyasi (FCS) yordamida uch nusxada aniqlandi (qo'shimcha ma'lumot uchun 3-rasm va usullarga qarang).d LLPS buferidagi 100 mkM TEMPOL-122-aS doimiy X-diapazonli EPR spektrlari hech qanday polikatiyasiz (qora) yoki 100 mkM Tau441 (qizil) yoki DNt-Tau (ko'k) yoki 1 mM pLK (yashil) mavjudligida.Insert eng keskin o'zgarishlar sodir bo'lgan kuchli maydon chiziqlarining kattalashtirilgan ko'rinishini ko'rsatadi.e LLPS yo'qligida (PEG yo'q) turli polikatsiyalar bilan 50 mkM TEMPOL-122-aS bog'lovchi egri chiziqlar.Normallashtirilgan EPR spektrining II (IIII/III) bandiga nisbatan III bandining kamaytirilgan amplitudasi Tau441 (qizil), DNt-Tau (ko'k) va pLK (yashil) ning molyar nisbatlarini oshirishi ko'rsatilgan.Rangli chiziqlar har bir egri chiziqda n ta bir xil va mustaqil bog'lanish joyiga ega bo'lgan qo'pol bog'lash modeli yordamida ma'lumotlarga mosligini ko'rsatadi.Xom ma'lumotlar xom ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.
Qo'shimcha sifatida biz yo'naltirilgan spin yorlig'i (SDSL) va uzluksiz elektron paramagnit rezonans (CW-EPR) yordamida turli koaservatlarda aS dinamikasini o'rganib chiqdik.Ushbu usul IDPning moslashuvchanligi va dinamikasi haqida real qoldiq ruxsat bilan hisobot berishda juda foydali ekanligini isbotladi36,37,38.Shu maqsadda biz bitta Cys mutantlarida sistein qoldiqlarini yaratdik va 4-gidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL) spin probidan foydalandik.Maleimid hosilalari ularni belgilaydi.Aniqroq aytganda, biz TEMPOL problarini 122 yoki 24 aS (TEMPOL-122-aS va TEMPOL-24-aS) holatiga joylashtirdik.Birinchi holda, biz polikatsiyalar bilan o'zaro ta'sir qilishda ishtirok etadigan oqsilning C-terminal mintaqasini nishonga olamiz.Buning o'rniga, 24-pozitsiya bizga kondensatdagi oqsillarning umumiy dinamikasi haqida ma'lumot berishi mumkin.Ikkala holatda ham dispers fazaning oqsillari uchun olingan EPR signallari tez harakatlanuvchi holatdagi nitroksid radikallariga to'g'ri keldi.Tau yoki pLK (100 mkM TEMPOL-aS, Tau441 yoki DNt-Tau 1:1 nisbatda yoki pLK 1:10 nisbatda) ishtirokida fazalar ajratilgandan so'ng, nisbiy cho'qqi intensivligining ortishi kuzatildi. aS ning EPR spektri.Yo'qotish chizig'i kengaytirildi, bu suyultirilgan fazadagi oqsilga nisbatan tomchilarda aS yo'nalishini o'zgartirish kinetikasining kamayganligini ko'rsatadi (3d-rasm, qo'shimcha 4a-rasm).Bu o'zgarishlar 122-pozitsiyada aniqroq namoyon bo'ladi. 24-pozitsiyada pLK mavjudligi zond kinetikasiga ta'sir qilmagan bo'lsa, 122-pozitsiyada spektral chiziq shakli sezilarli darajada o'zgargan (Qo'shimcha rasm. 4a).Spin-yorliqli IDP38,39 dinamikasini tavsiflash uchun odatda ishlatiladigan izotrop model (5a-rasm) yordamida ikkita aS/polikatsion tizimning 122-pozitsiyasidagi spektrlarni modellashtirishga harakat qilganimizda, biz eksperimental spektrlarni qayta tiklay olmadik..24 ta aylanish kontrastlari pozitsiyasining spektral simulyatsiyasi (Qo'shimcha rasm 5a).Bu polikatsiyalar mavjud bo'lganda aS ning C-terminal mintaqasining spin konfiguratsiyalari bo'shlig'ida imtiyozli pozitsiyalar mavjudligini ko'rsatadi.Eksperimental EPR sharoitida (aS/Tau441, aS/DNt-Tau va aS/pLK uchun mos ravishda 84 ± 2%, 79 ± 7% va 47 ± 4%) kondensatsiyalangan fazadagi aS ulushini ko'rib chiqishda - Qo'shimchaga qarang. Ma'lumotlarni tahlil qilishning 2e-rasmidan ko'rinib turibdiki, EPR usuli bilan aniqlangan kengayish asosan aS ning C-terminal mintaqasining kondensatsiyalangan fazadagi turli xil polikatsiyalar bilan o'zaro ta'sirini aks ettiradi (TEMPOL-122-dan foydalanishdagi asosiy o'zgarish) aS) va oqsil kondensatsiyasi emas.Probda mikroviskozitenin ortishi kuzatiladi.Kutilganidek, aralashmaga 1 M NaCl qo'shilganda, LLPSdan tashqari sharoitlarda oqsilning EPR spektri to'liq tiklandi (Qo'shimcha rasm. 4b).Umuman olganda, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, CW-EPR tomonidan aniqlangan o'zgarishlar asosan aS ning C-terminal mintaqasining kondensatsiyalangan fazadagi turli polikatsiyalar bilan o'zaro ta'sirini aks ettiradi va bu o'zaro ta'sir pLK bilan Tauga qaraganda kuchliroq ko'rinadi.
Koaservatdagi oqsillar haqida ko'proq strukturaviy ma'lumot olish uchun biz eritmada NMR yordamida LLPS tizimini o'rganishga qaror qildik.Biroq, biz faqat dispers fazada qolgan aS fraktsiyasini aniqlay oldik, bu koaservat ichidagi oqsil dinamikasining pasayishi va NMR tahlilida eritmaning pastki qismidagi zich faza bilan bog'liq bo'lishi mumkin.NMR yordamida LLPS namunasining dispers bosqichida qolgan oqsilning tuzilishi va dinamikasini tahlil qilganimizda (Qo'shimcha rasm 5c, d), biz oqsilning pLK va DNt-Tau ishtirokida deyarli bir xil harakat qilganini payqadik. Ikkilamchi kimyoviy siljish va R1r relaksatsiyasi bo'yicha tajribalar natijasida aniqlangan oqsil magistralining ikkilamchi tuzilishi va dinamikasida bo'lgan.NMR ma'lumotlari shuni ko'rsatadiki, aS ning C-terminali polikatsiyalar bilan o'zaro ta'siri tufayli oqsillar ketma-ketligining qolgan qismi kabi tartibsiz tabiatini saqlab, konformatsion moslashuvchanlikni sezilarli darajada yo'qotadi.
TEMPOL-122-aS kondensatsiyalangan fazasida kuzatilgan CW-EPR signalining kengayishi oqsilning polikationlar bilan o'zaro ta'sirini aks ettirganligi sababli, biz LLPS yo'qligida aS ning turli polikatsiyalar bilan bog'lanish yaqinligini baholash uchun EPR titrlashini amalga oshirdik (to'planmagan). Bufer LLPS), o'zaro ta'sirlar suyultirilgan va konsentrlangan fazalarda bir xil ekanligini ko'rsatadi (bu bizning ma'lumotlarimiz bilan tasdiqlangan, Qo'shimcha 4a-rasm va 6-rasm).Maqsad, barcha koaservatlarning umumiy suyuqlikka o'xshash xususiyatlariga qaramay, molekulyar darajada har qanday asosiy differentsial xatti-harakatlarini ko'rish edi.Kutilganidek, EPR spektri polikatatsiya kontsentratsiyasining ortishi bilan kengaydi, bu barcha o'zaro ta'sir sheriklarining molekulyar o'zaro ta'siri tufayli molekulyar moslashuvchanlikning deyarli to'yingangacha pasayishini aks ettiradi (3e-rasm, qo'shimcha 6-rasm).pLK bu to'yinganlikka DNt-Tau va Tau441 bilan solishtirganda pastroq molyar nisbatda (polikatatsiya: aS) erishdi.Darhaqiqat, n ta bir xil va mustaqil bog'lanish joylarini nazarda tutgan holda, ma'lumotlarni taxminiy bog'lash modeli bilan taqqoslash shuni ko'rsatdiki, pLK ning (~ 5 mkM) ko'rinadigan dissotsiatsiya konstantasi Tau441 yoki DNt-Tau (~ 50 mM) dan pastroq kattalikdagi tartibdir. ).µM).Garchi bu taxminiy baho bo'lsa-da, bu aS doimiy musbat zaryadli hududlarga ega oddiy polikatsiyalar uchun yuqori yaqinlikka ega ekanligini ko'rsatadi.aS va turli xil polikatsiyalar o'rtasidagi yaqinlikdagi bu farqni hisobga olgan holda, biz ularning suyuqlik xossalari vaqt o'tishi bilan boshqacha o'zgarishi va shuning uchun turli LSPT jarayonlaridan aziyat chekishi mumkinligini taxmin qildik.
Protein koaservati ichidagi juda olomon muhitni va oqsilning amiloid tabiatini hisobga olgan holda, biz mumkin bo'lgan LSPT jarayonlarini aniqlash uchun vaqt o'tishi bilan koaservatning xatti-harakatlarini kuzatdik.BF va CF mikroskopidan foydalangan holda (4-rasm) biz aS/Tau441 eritmada katta darajada koaservatsiyalanishini, quduq tubidagi katta tomchilarni hosil qilishini va kutilgandek to'liq tomchilar sifatida namlashini kuzatdik (Qo'shimcha rasm). 7d);biz bu tubdan hosil bo'lgan tuzilmalarni "oqsilli raflar" deb ataymiz.Ushbu tuzilmalar suyuqlik bo'lib qoldi, chunki ular birlashish qobiliyatini saqlab qoldi (Qo'shimcha rasm. 7b) va LLPS ishga tushirilgandan keyin bir necha soat davomida ko'rish mumkin edi (4-rasm va qo'shimcha 7c-rasm).Biz namlash jarayoni muvozanatsiz zaryadli elektrostatik koaservatlar va shuning uchun yuqori elektrostatik sirt potentsiali uchun kutilganidek, hidrofobik emas, balki hidrofilik materiallar yuzasida ma'qullanganini kuzatdik (Qo'shimcha rasm. 7a).Ta'kidlash joizki, aS / DNt-Tau birlashishi va raftingi sezilarli darajada kamaydi, aS / pLK kondensatlari esa sezilarli darajada kamaydi (4-rasm).Qisqa inkubatsiya vaqtida aS/pLK tomchilari birlashishi va gidrofil sirtini namlashi mumkin edi, lekin bu jarayon tezda to'xtadi va 5 soatlik inkubatsiyadan so'ng faqat cheklangan birlashish hodisalari va namlanish kuzatilmadi.- gel-tomchil o'tish.
LLPS buferida 100 µM Tau441 (yuqori) lyuminestsent tasvirlar mavjudligida 100 µM aS (1% lyuminestsent yorliq) o‘z ichiga olgan koaservat namunalarining BF (kulrang rangli panellar) va CF (o‘ng panellar, AF488 yorlig‘i yashil rangda) -Tau (markazda) yoki 1 mM pLK (pastki) turli inkubatsiya vaqtlari va fokusli balandliklarda (z, plastinka qudug'ining pastki qismidan masofa).Tajribalar bir xil natijalar bilan bir-biridan mustaqil ravishda 4-6 marta takrorlandi.aS/Tau441 koaservatlari 24 soatdan keyin namlanadi va tasvirdan kattaroq raflarni hosil qiladi.Barcha tasvirlar uchun masshtab paneli 20 mikron.
Keyin biz aS / Tau441 LLPSda hosil bo'lgan katta suyuqlikka o'xshash oqsil hovuzlari o'rganilgan oqsillarning amiloid to'planishiga olib keladimi yoki yo'qligini so'radik.Biz aS / Tau441 tomchilarining vaqt o'tishi bilan WF mikroskopiyasi bilan yuqoridagi kabi sharoitlarda, lekin 1 mkM AF488 etiketli aS va Atto647N etiketli Tau441 dan foydalangan holda kuzatdik (5a-rasm).Kutilganidek, biz butun etilish jarayonida to'liq protein lokalizatsiyasini kuzatdik.Qizig'i shundaki, taxminan.5 soatdan so'ng, raflar ichida biz "nuqtalar" deb nomlagan yanada kuchli aylana bo'lmagan tuzilmalar kuzatildi, ularning ba'zilari aS bilan kolokalizatsiya qilindi, ba'zilari esa Tau441da boyitilgan (5a-rasm, oq o'qlar).Bu dog'lar har doim aS/DNt-Tauga qaraganda aS/DNt-Tau uchun ko'proq sallar ichida kuzatilgan.pLK va Tau tizimlarining tomchilarida termoyadroviy/ho'llanishga qodir bo'lmagan aniq dog'lar yo'q edi.aS va Tau441 ni o'z ichiga olgan bu dog'lar amiloidga o'xshash agregatlar yoki yo'qligini tekshirish uchun biz CF mikroskopidan foydalangan holda shunga o'xshash tajriba o'tkazdik, unda Tau441 Atto647N bilan belgilangan va boshidan 12,5 mkM amiloidga xos tioflavin-T (ThT) qo'shilgan.bo'yoq.24 soatlik inkubatsiyadan keyin ham aS/Tau441 tomchilari yoki raftlarining ThT-bo'yalishi kuzatilmagan bo'lsa ham (5b-rasm, yuqori qator - oqsilli raflar ustida qolgan tomchilar), raflar ichida Atto647N-Tau441 o'z ichiga olgan ThT-musbat tuzilmalar juda zaif edi.bu avval tasvirlangan dog'larning o'lchami, shakli va joylashishini takrorlaydi (5b-rasm, o'rta va pastki qatorlar), bu dog'lar qarigan suyuqlik koaservatlarida hosil bo'lgan amiloidga o'xshash agregatlarga mos kelishi mumkinligini ko'rsatadi.
LLPS tamponli mikroskop plitasining qudug'ida 25 mkM Tau441 (1 mkM AF488 etiketli aS va Atto647N etiketli Tau441) mavjud bo'lganda, turli inkubatsiya vaqtlarida va fokusli balandliklarda (z, bog'lanmagan pastdan masofa) WF 25 mM aS. .Oltita tajriba o'xshash natijalar bilan mustaqil ravishda takrorlandi.b 25 mkM Tau441 (1 mkM Atto647N etiketli Tau441) va 12,5 mkM tioflavin-T (ThT) mavjudligida 25 mkM aS ning CF mikroskopik tasviri.Yuqori va o'rta qatorlarda o'lchangan oqsil tomchilari va cho'ktirilgan oqsillar va dog'lar mos ravishda ko'rsatilgan.Pastki qatorda 3 ta mustaqil replikatsiyadan raftlar va tomchilar tasvirlari ko'rsatilgan.Oq o'qlar ikkala paneldagi ThT-musbat nuqtalarni ko'rsatadi.Barcha tasvirlar uchun masshtab paneli 20 mikron.
Suyuqlikdan qattiq holatga o'tish jarayonida koaservat oqsil tarmog'idagi o'zgarishlarni batafsilroq o'rganish uchun biz umr bo'yi floresan ko'rish (FLIM) va Förster rezonans energiya uzatish mikroskopiyasidan (FRET) foydalandik (6-rasm va qo'shimcha 8 va 9-rasmlar).Biz faraz qildikki, qatlamning koaservatning yanada quyuqlashgan yoki hatto qattiq shaklga o'xshash agregatlangan oqsil strukturasiga aylanishi oqsil va unga biriktirilgan lyuminestsent zond o'rtasida yaqinroq aloqaga olib keladi va potentsial ravishda probning ishlash muddati qisqartirilganda (t) namoyon bo'ladigan söndürme ta'sirini keltirib chiqaradi. , avval aytib o'tilganidek40.,41 ,42.Bundan tashqari, er-xotin etiketli namunalar uchun (FRET donor va qabul qiluvchi bo'yoqlar sifatida AF488 va Atto647N mos ravishda), t ning bu pasayishi, shuningdek, LSPT paytida koaservat kondensatsiyasi va FRET (E) samaradorligining oshishi bilan birga bo'lishi mumkin.Biz LLPS aS/Tau441 va aS/DNt-Tau namunalarida vaqt oʻtishi bilan raft va dogʻ hosil boʻlishini kuzatdik (tau441 yoki DNt-Tau etiketli aS va/yoki Atto647N etiketli 1 mkM AF488 oʻz ichiga olgan LLPS buferidagi har bir oqsilning 25 mkM).Biz umumiy tendentsiyani kuzatdik, chunki AF488 (t488) va Atto647N (t647N) zondlarining floresans muddati koaservatlar pishib qolganda biroz qisqardi (6-rasm va qo'shimcha rasm 8c).Qizig'i shundaki, bu o'zgarish raftlar ichidagi nuqtalar uchun sezilarli darajada yaxshilangan (6c-rasm), bu nuqtalarda keyingi oqsil kondensatsiyasi sodir bo'lganligini ko'rsatadi.Buni qo'llab-quvvatlash uchun, 24 soat davomida saqlanadigan aS/DNt-Tau tomchilari uchun flüoresans muddatida sezilarli o'zgarishlar kuzatilmadi (Qo'shimcha rasm. 8d), bu tomchilarning jelleşmesi dog'lanishdan farq qiladigan jarayon ekanligini va bu muhim molekulyar qayta tashkil etilishi bilan birga bo'lmasligini ko'rsatadi. koaservatlar ichida.Shuni ta'kidlash kerakki, nuqtalar aSda, ayniqsa aS/Tau441 tizimi uchun turli o'lchamlarga va o'zgaruvchan tarkibga ega (Qo'shimcha rasm 8e).Spot floresansning ishlash muddatining pasayishi, ayniqsa, Tau441 etiketli Atto647N uchun intensivlikning oshishi (qo'shimcha rasm 8a) va aS/Tau441 va aS/DNt-Tau tizimlari uchun yuqori FRET samaradorligi bilan birga bo'ldi, bu esa LL-da yana besh soatlik kondensatsiyani ko'rsatadi. tetiklashdan so'ng, statik elektr ichidagi oqsillar kondensatsiyalanadi.aS/DNt-Tau bilan solishtirganda, biz aS/Tau441 nuqtalarida t647N past va biroz yuqoriroq t488 qiymatlarini kuzatdik, bu esa pastroq va bir hil bo'lmagan FRET qiymatlari bilan birga keladi.Ehtimol, bu aS / Tau441 tizimida aS / Tau 441 tizimida aS ning kuzatilgan va kutilgan ko'pligi Tau bilan solishtirganda ko'proq heterojen, ko'pincha substoxiometrik bo'lishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, chunki Tau441 ning o'zi ham LLPS va agregatsiyadan o'tishi mumkin (Qo'shimcha 8e-rasm). .Biroq, suyuqlikka o'xshash koaservatlar ichida tomchilarning birlashishi, raftlar hosil bo'lishi va eng muhimi, oqsil to'planishi darajasi Tau441 va aS mavjud bo'lganda maksimal bo'ladi.
aS/Tau441 va aS/DNt-Tau ning umr bo'yi lyuminestsent mikroskopiyasi (FLIM) tasvirlari, har bir oqsilning 25 mkM miqdorida (1 mkM AF488 etiketli aS va 1 mkM Atto647N etiketli Tau441 yoki DNt-Tau buffer)Ustunlarda LLPS namunalarining turli xil pishib etish vaqtlarida (30 min, 5 soat va 24 soat) vakillik tasvirlari ko'rsatilgan.Qizil ramkada aS/Tau441 nuqtalari joylashgan hudud ko'rsatilgan.Yaroqlilik muddati rangli chiziqlar sifatida ko'rsatilgan.Barcha tasvirlar uchun masshtab paneli = 20 mikron.b Tanlangan hududning kattalashtirilgan FLIM tasviri a paneldagi qizil qutida ko'rsatilgan.Yaroqlilik diapazonlari a panelidagi kabi bir xil rang shkalasi yordamida ko'rsatilgan.O'lchov paneli = 5 mikron.c aS- uchun yozilgan FLIM tasvirlarida aniqlangan turli xil oqsil turlari (tomchilar-D-, raft-R- va nuqta-P) uchun AF488 (aS-ga biriktirilgan) yoki Atto647N (Tau-ga biriktirilgan) ko'rsatilgan gistogrammalar Tau441 va Tau441-ning vaqt taqsimoti muddati aS/DNt-Tau koaservat namunalari (D uchun N = 17-32 ROI, R uchun 29-44 ROI va ball uchun 21-51 ROI).O'rtacha va median qiymatlar mos ravishda qutilar ichida sariq kvadratlar va qora chiziqlar sifatida ko'rsatilgan.Qutining pastki va yuqori chegaralari mos ravishda birinchi va uchinchi kvartillarni ifodalaydi va 1,5 baravar interquartile diapazoni (IQR) ichidagi minimal va maksimal qiymatlar mo'ylov sifatida ko'rsatilgan.Chiqib ketishlar qora olmos sifatida ko'rsatilgan.Tarqatish juftliklari o'rtasidagi statistik ahamiyatga ega bo'lgan farqlar teng bo'lmagan farqlarni hisobga olgan holda ikkita namunali t-testi yordamida aniqlandi.Ikki dumli t-test p-qiymatlari taqqoslangan ma'lumotlarning har bir juftligi uchun yulduzcha bilan ko'rsatilgan (* p-qiymati > 0,01, ** p-qiymati > 0,001, *** p-qiymati > 0,0001, **** p-qiymati > 0,00001), ns ahamiyatsizligini bildiradi (p-qiymati > 0,05).Aniq p qiymatlari 1-jadvalda keltirilgan va asl ma'lumotlar xom ma'lumotlar fayllari sifatida taqdim etilgan.
Ko'zoynaklar/agregatlarning amiloidga o'xshash tabiatini yanada ko'proq ko'rsatish uchun biz bo'yalmagan koaservat namunalarini 24 soat davomida yuqori konsentratsiyali (1 M) NaCl bilan ishlov berdik, bu esa agregatlarni oqsil koaservatlaridan ajratishga olib keldi.Izolyatsiya qilingan agregatlar (ya'ni, agregatlarning dispers eritmasi) atom kuch mikroskopiyasi (AFM) yordamida kuzatilganda, biz odatdagi balandligi taxminan 15 nm bo'lgan, asosan, sferik morfologiyani kuzatdik, ular yuqori tuz konsentratsiyasi sharoitida bog'lanishga moyil bo'ladi. sirtdagi kuchli hidrofobik ta'sir tufayli tipik amiloid fibrillalarining xatti-harakati (fibrillalar odatda ~10 nm balandlikka ega ekanligini unutmang) (Qo'shimcha rasm. 10a).Qizig'i shundaki, ajratilgan agregatlar standart ThT floresan tahlilida ThT bilan inkubatsiya qilinganida, biz ThT floresansi kvant rentabelligining keskin o'sishini kuzatdik, bu bo'yoq odatdagi aS amiloid fibrillalari bilan inkubatsiya qilinganida kuzatilganiga qiyoslanadi (qo'shimcha rasm 10b), koaservat agregatlarida amiloidga o'xshash tuzilmalar mavjud..Aslida, agregatlar yuqori tuz konsentratsiyasiga chidamli edi, lekin odatdagi amiloid fibrillalari kabi 4 M guanidin xloridga (GdnHCl) sezgir edi (Qo'shimcha rasm 10c).
Keyinchalik, biz bitta molekulali floresans, o'ziga xos flüoresan korrelyatsiya / o'zaro bog'liqlik spektroskopiyasi (FCS / FCS) va ikki rangli tasodifni aniqlashning portlash tahlili (TCCD) yordamida agregatlarning tarkibini tahlil qildik.Shu maqsadda biz aS va Tau441 (ikkalasi 25 mkM) ni o'z ichiga olgan 100 mkl LLPS namunalarida 24 soatlik inkubatsiyadan so'ng hosil bo'lgan agregatlarni 1 mkM AF488 etiketli aS va 1 mkM Atto647N etiketli Tau441 bilan ajratib oldik.Olingan disperslangan agregat eritmasini bir xil PEGsiz tampon va 1 M NaCl (agregatlarni koaservatdan ajratish uchun ishlatiladigan bir xil tampon) yordamida monomolekulyar holatga suyultiring, LLPS va oqsil o'rtasidagi mumkin bo'lgan elektrostatik o'zaro ta'sirlarni oldini oling.Bitta molekulaning vaqt traektoriyasining misolini 7a-rasmda ko'rish mumkin.FCCS/FCS tahlili (o'zaro bog'liqlik, CC va avtokorrelyatsiya, AC) namunalarda aS va tau ni o'z ichiga olgan agregatlar ko'p ekanligini ko'rsatdi (7b-rasmdagi CC egri chizig'iga qarang, chap panel) va qoldiq monomerik oqsilning ortiqcha miqdori paydo bo'ldi. suyultirish jarayonining natijasi (7b-rasmdagi AC egri chiziqlarga qarang, chap panel).Faqat monomerik oqsillarni o'z ichiga olgan namunalar yordamida bir xil eritma sharoitida o'tkazilgan nazorat tajribalari hech qanday CC egri chizig'ini ko'rsatmadi va AC egri monomerik oqsillar kutilgan diffuziya koeffitsientlariga ega bo'lgan bir komponentli diffuziya modeliga (4- tenglama) yaxshi mos keladi (7b-rasm). ), o'ng panel).Agregatlangan zarrachalarning diffuziya koeffitsienti 1 mkm2/s dan kam, monomerik oqsillarniki esa taxminan 1 mkm2/s ni tashkil qiladi.50–100 mkm/s;qiymatlar o'xshash eritma sharoitida alohida soniklangan aS amiloid fibrillalari va monomerik aS uchun ilgari e'lon qilingan qiymatlarga o'xshaydi44.Biz agregatlarni TCCD portlash tahlili bilan tahlil qilganimizda (7c-rasm, yuqori panel), biz har bir ajratilgan agregatda (aS/Tau heteroagregati) aniqlangan agregatlarning taxminan 60% aS va tau ni, taxminan 30% ni oʻz ichiga olganligini aniqladik. tau, faqat taxminan 10% aS.aS/Tau heteroagregatlarining stoxiometrik tahlili shuni ko'rsatdiki, ko'pchilik heteroagregatlar tau bilan boyitilgan (stoixiometriya 0,5 dan past, agregatdagi tau molekulalarining o'rtacha soni aS molekulalaridan 4 baravar ko'p), bu bizning situdagi FLIMda kuzatilgan ishimizga mos keladi. tajribalar..FRET tahlili shuni ko'rsatdiki, bu agregatlar ikkala oqsilni ham o'z ichiga oladi, ammo bu holda FRETning haqiqiy qiymatlari katta ahamiyatga ega emas, chunki har bir agregatda ftoroforlarning taqsimlanishi tajribada ishlatilgan etiketlanmagan oqsilning ko'pligi sababli tasodifiy edi.Qizig'i shundaki, biz 45,46 etuk amiloid agregatsiyasi yetishmaydigan Tau variantidan foydalangan holda xuddi shu tahlilni o'tkazganimizda (qo'shimcha 11a, b-rasmga qarang), aS elektrostatik agregatsiyasi bir xil bo'lsa ham (qo'shimcha 11c, d), koaservat ichida agregatlar hosil qilish qobiliyati keskin kamaydi va FLIM in situ tajribalarida bir nechta dog'larni aniqladi va izolyatsiya qilingan agregat namunalari uchun zaif o'zaro bog'liqlik egri chiziqlari kuzatildi.Biroq, oz sonli aniqlangan agregatlar uchun (Tau441 ning atigi o'ndan biri) biz har bir agregat ushbu Tau variantiga qaraganda aS ga boyitilganligini kuzatdik, aniqlangan agregatlarning taxminan 50% faqat aS molekulalarini o'z ichiga oladi va aS ortiqcha heterojen edi. .agregatlar (Qo'shimcha 11e-rasmga qarang), Tau441 tomonidan yaratilgan heterojen agregatlardan farqli o'laroq (6f-rasm).Ushbu tajribalar natijalari shuni ko'rsatdiki, aS ning o'zi koaservat ichida tau bilan to'planish qobiliyatiga ega bo'lsa-da, tau yadrolanishi bu sharoitda qulayroq bo'ladi va hosil bo'lgan amiloidga o'xshash agregatlar aS va tau shakli sifatida harakat qila oladi.Biroq, tauga boy yadro hosil bo'lgach, aS va tau o'rtasidagi geterotipik o'zaro ta'sirlar tau molekulalari orasidagi gomotipik o'zaro ta'sirlardan ko'ra agregatlarda afzal ko'riladi;suyuq aS/tau koaservatlarida oqsil tarmoqlarini ham kuzatamiz.
aS/Tau441 elektrostatik koaservatlarida hosil bo'lgan izolyatsiyalangan agregatlarning yagona molekulalarining vakili floresan temporal izlari.aS/Tau441 koagregatlariga mos keladigan portlashlar (ko'rsatilgan chegaradan yuqori portlashlar) uchta aniqlash kanalida kuzatildi (to'g'ridan-to'g'ri qo'zg'alishdan keyin AF488 va Atto647N emissiyasi, ko'k va qizil chiziqlar, bilvosita qo'zg'alishdan keyin Atto647N emissiyasi), FRET, binafsha chiziq).b LLPS dan olingan izolyatsiyalangan aS/Tau441 agregatlari namunasining FCS/FCCS tahlili (chap panel).AF488 va Atto647N uchun avtokorrelyatsiya (AC) egri mos ravishda ko'k va qizil rangda ko'rsatilgan va ikkala bo'yoqni o'z ichiga olgan agregatlar bilan bog'liq o'zaro bog'liqlik (CC) egri binafsha rangda ko'rsatilgan.AC egri chiziqlari etiketli monomerik va agregatlangan oqsil turlarining mavjudligini aks ettiradi, CC egri chiziqlar esa faqat ikki yorliqli agregatlarning tarqalishini ko'rsatadi.Xuddi shu tahlil, lekin izolyatsiyalangan joylardagi kabi bir xil eritma sharoitida, faqat monomerik aS va Tau441 ni o'z ichiga olgan namunalar o'ng panelda boshqaruv elementlari sifatida ko'rsatilgan.c aS/Tau441 elektrostatik koaservatlarida hosil bo'lgan izolyatsiyalangan agregatlarning yagona molekulalarining floresan flesh tahlili.To'rt xil takrorlashda topilgan har bir agregat uchun ma'lumot (N = 152) ularning stexiometriyasi, S qiymatlari va FRET samaradorligiga (yuqori panel, rang paneli paydo bo'lishini aks ettiradi) qarshi chizilgan.Uch turdagi agregatlarni ajratib ko'rsatish mumkin: -aS-faqat S~1 va FRET~0 bo'lgan agregatlar, S~0 va FRET~1 bilan faqat Tau agregatlari va oraliq S va FRETli heterojen Tau/aS agregatlari. Har bir heterojen agregatda aniqlangan ikkala marker oqsilining (N = 100) pastki panelda ko'rsatilgan (rang shkalasi hodisani aks ettiradi).Xom ma'lumotlar xom ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.
Suyuq oqsil kondensatlarining vaqt o'tishi bilan jelga o'xshash yoki qattiq tuzilmalarga yetilishi yoki qarishi kondensatning bir qancha fiziologik funktsiyalarida ishtirok etishi47, shuningdek, amiloid agregatsiyasidan oldingi g'ayritabiiy jarayon sifatida kasalliklarda ishtirok etishi xabar qilingan 7, 48, 49. fazalarni ajratish va xatti-harakatlarni batafsil o'rganamiz.Past mikromolyar konsentratsiyalarda va fiziologik jihatdan tegishli sharoitlarda nazorat qilinadigan muhitda tasodifiy polikatsiyalar mavjud bo'lganda LSPT aS (aS ning hisoblangan fiziologik kontsentratsiyasi >1 µM50 ekanligini e'tiborga oling), LPSning odatda termodinamik boshqariladigan xatti-harakatidan keyin.Biz fiziologik pH da yuqori manfiy zaryadlangan C-terminal hududini o'z ichiga olgan aS elektrostatik jarayon orqali pLK yoki Tau kabi yuqori katyonik tartibsiz peptidlar ishtirokida LLPS orqali suvli eritmada oqsilga boy tomchilarni hosil qila olishini aniqladik. agregatsion makromolekulalar ishtirokida murakkab kondensatsiya.Bu jarayon hujayra muhitida tegishli ta'sirga ega bo'lishi mumkin, bu erda aS in vitro va in vivo 51,52,53,54 kasallik bilan bog'liq agregatsiya bilan bog'liq turli xil polikatyonik molekulalarga duch keladi.
Ko'pgina tadqiqotlarda tomchilar ichidagi oqsil dinamikasi etilish jarayonini belgilovchi asosiy omillardan biri sifatida ko'rib chiqilgan55,56.Elektrostatik aS ning polikationlar bilan koaservatlarida yetilish jarayoni ko‘rinishidan polikationlar bilan o‘zaro ta’sir kuchiga, valentlikka va bu o‘zaro ta’sirlarning ko‘pligiga bog‘liq.Muvozanat nazariyasi shuni ko'rsatadiki, ikkita suyuqlik holatining muvozanat landshafti LLPS 57,58 ni harakatga keltiradigan biopolimerlarga boy katta tomchi mavjudligidir.Tomchilarning o'sishiga Ostvaldning pishishi59, birlashishi60 yoki dispers fazada erkin monomerni iste'mol qilish orqali erishish mumkin61.aS va Tau441, DNt-Tau yoki pLK uchun oqsilning ko'p qismi ushbu tadqiqotda qo'llaniladigan sharoitlarda kondensatda to'plangan.Biroq, to'liq o'lchamli tau tomchilari sirt namlanganda tezda birlashgan bo'lsa-da, tomchilarning birlashishi va namlanishi DNt-Tau va pLK uchun qiyin bo'lib, bu ikki tizimda suyuqlik xususiyatlarining tez yo'qolishini ko'rsatadi.Bizning FLIM-FRET tahlilimizga ko'ra, keksa pLK va DNt-Tau tomchilari asl tomchilar kabi oqsil to'planishining o'xshash darajasini (o'xshash flüoresan umri) ko'rsatdi, bu esa asl oqsil tarmog'i qattiqroq bo'lsa-da, saqlanib qolganligini ko'rsatadi.
Eksperimental natijalarimizni quyidagi modelda ratsionalizatsiya qilamiz (8-rasm).Dastlab vaqtinchalik hosil bo'lgan tomchilar ko'pincha elektrostatik kompensatsiyaga ega bo'lmagan oqsil tarmoqlari bo'lib, shuning uchun, ayniqsa, tomchilar interfeysida zaryad nomutanosibligi joylari mavjud bo'lib, natijada yuqori elektrostatik sirt salohiyatiga ega bo'lgan tomchilar paydo bo'ladi.Zaryadni qoplash (odatda valentlikning kamayishi deb ataladigan hodisa) va tomchilarning sirt potentsialini minimallashtirish uchun tomchilar suyultirilgan fazadan yangi polipeptidlarni o'z ichiga olishi, zaryad-zaryad o'zaro ta'sirini optimallashtirish uchun oqsil tarmoqlarini qayta tashkil etishi va boshqa tomchilar bilan o'zaro ta'sir qilishi mumkin.yuzalar bilan (namlash).aS/pLK tomchilari oddiyroq oqsil tarmog'i (faqat aS va pLK o'rtasidagi heterotipik o'zaro ta'sirlar) va oqsil-oqsil o'zaro ta'siriga ko'proq yaqinligi tufayli kondensat zaryadini tezroq muvozanatlashtira oladi;Darhaqiqat, biz aS / Tau ga qaraganda dastlab hosil bo'lgan aS / pLK koaservatlarida tezroq oqsil kinetikasini kuzatdik.Valentlik kamayib ketgandan so'ng, o'zaro ta'sirlar kamroq efemer bo'ladi va tomchilar suyuq xususiyatlarini yo'qotadi va past elektrostatik sirt potentsiali (va shuning uchun sirtni namlash mumkin emas) bo'lgan jelga o'xshash, yonmaydigan tomchilarga aylanadi.Bundan farqli o'laroq, aS / Tau tomchilari yanada murakkab oqsil tarmoqlari (homotipik va geterotipik o'zaro ta'sirlar bilan) va oqsil o'zaro ta'sirining zaif tabiati tufayli tomchi zaryad balansini optimallashtirishda unchalik samarali emas.Bu uzoq vaqt davomida suyuqlikning harakatini saqlaydigan va yuqori elektrostatik sirt potentsialini namoyish etadigan tomchilarga olib keladi, ular birlashish va o'sish (shuning uchun tomchilarning sirt maydoni / hajmi nisbati minimallashtiriladi) va gidrofil sirt kimyosini namlash orqali minimallashtiriladi.Bu suyuqlik xususiyatlarini saqlaydigan katta konsentrlangan oqsil kutubxonalarini yaratadi, chunki oqsil tarmog'ida zaryadni optimallashtirish uchun doimiy izlanishlar tufayli o'zaro ta'sirlar juda o'tkinchi bo'lib qoladi.Qizig'i shundaki, Tauning N-terminal kesilgan shakllari, jumladan, ba'zi tabiiy izoformlar62, oraliq xatti-harakatni namoyon qiladi, ba'zi koaservatlar aS bilan qariydi, uzoq muddatli jelga o'xshash tomchilarga aylanadi, boshqalari esa katta suyuqlik kondensatlariga aylanadi.aS elektrostatik koaservatlarining etukligidagi bu ikkilik LLPSning so'nggi nazariy va eksperimental tadqiqotlariga mos keladi, ular kondensat hajmi va suyuqlik xususiyatlarini nazorat qilishning kaliti sifatida kondensatlarda valentlikning kamayishi va elektrostatik saralash o'rtasidagi bog'liqlikni aniqladi.Mexanizm 58.61.
Ushbu sxema LLPS va LSPT orqali aS va Tau441 uchun taxminiy amiloid agregatsiya yo'lini ko'rsatadi.Qo'shimcha anionlarga boy (qizil) va kationga boy (ko'k) hududlar bilan, qoniqarli valentlikka ega aS va tau elektrostatik koaservatlar pastroq sirt energiyasiga ega va shuning uchun kamroq birlashishga ega, bu esa tomchilarning tez qarishiga olib keladi.Barqaror aglomeratsiyalanmagan jel holatiga erishiladi..Bu holat aS/pLK tizimida yuqori yaqinlik va oddiyroq oqsil-juft o'zaro ta'sir tarmog'i tufayli juda qulaydir, bu esa jelga o'xshash tez o'tishga imkon beradi.Aksincha, qoniqarsiz valentlikka ega bo'lgan tomchilar va shuning uchun o'zaro ta'sir qilish uchun mavjud bo'lgan oqsil-zaryadli hududlar koaservatning yuqori sirt energiyasini kamaytirish uchun gidrofil sirtni eritish va namlashni osonlashtiradi.Bu holat zaif Tau-Tau va aS-Tau o'zaro ta'siridan iborat ko'p valentli murakkab tarmoqqa ega bo'lgan aS/Tau441 koaservatlari uchun afzalroqdir.O'z navbatida, kattaroq koaservatlar o'zlarining suyuqlikka o'xshash xususiyatlarini saqlab qolishadi, bu esa boshqa oqsil-oqsil o'zaro ta'sir qilishiga imkon beradi.Oxir-oqibat, aS va tau ni o'z ichiga olgan amiloid heterojen agregatlar koaservat suyuqligida hosil bo'ladi, bu neyrodegenerativ kasalliklarning belgilari bo'lgan inklyuziya tanalarida topilganlar bilan bog'liq bo'lishi mumkin.
aS/Tau441 ning pishib etish jarayonida hosil boʻlgan katta suyuqlikka oʻxshash tuzilmalar yuqori tiqilib qolgan, ammo dinamik oqsil muhiti va kamroq darajada aS/DNt-Tau koaservatlari oqsil agregatsiyasining yadrolanishi uchun ideal rezervuar hisoblanadi.Biz haqiqatan ham ushbu turdagi oqsil koaservatlarida qattiq oqsil agregatlarining shakllanishini kuzatdik, ular ko'pincha aS va tau ni o'z ichiga oladi.Biz bu heteroagregatlarning elektrostatik bo'lmagan o'zaro ta'sirlar bilan barqarorlashishini, amiloidga xos ThT bo'yoqlarini odatdagi amiloid fibrillalari bilan bir xil tarzda bog'lashga qodirligini va haqiqatan ham turli ta'sirlarga o'xshash qarshilikka ega ekanligini ko'rsatdik.LLPS tomonidan hosil qilingan aS / tau agregatlari amiloidga o'xshash xususiyatlarga ega ekanligi ko'rsatildi.Haqiqatan ham, amiloid agregatsiyasida etishmayotgan Tauning etuk varianti suyuq elektrostatik koaservat ichida bu heterojen aS agregatlarining shakllanishida sezilarli darajada buziladi.aS/Tau441 agregatlarining hosil bo'lishi faqat suyuqlikka o'xshash xususiyatlarni saqlab qolgan koaservatlar ichida kuzatilgan va agar koaservatlar/tomchilar jel holatiga etib bormasa, hech qachon kuzatilmagan.Ikkinchi holda, elektrostatik o'zaro ta'sirlarning kuchayishi va natijada, oqsil tarmog'ining qattiqligi amiloid yadrolari uchun zarur bo'lgan yangi oqsil o'zaro ta'sirini o'rnatish uchun oqsillarning zarur konformatsion qayta tuzilishini oldini oladi.Biroq, bunga ko'proq moslashuvchan, suyuqlikka o'xshash koaservatlarda erishish mumkin, ular o'z navbatida hajmi oshgani sayin suyuq bo'lib qolish ehtimoli ko'proq.
Katta aS/Tau kondensatlarida kondensatsiyalangan fazada agregatlarning hosil bo'lishi tez gellanadigan mayda tomchilarga qaraganda afzalroq ekanligi tomchilar birikishini boshqaradigan omillarni aniqlashning dolzarbligini ta'kidlaydi.Shunday qilib, nafaqat fazalarni ajratish tendentsiyasi mavjud, balki to'g'ri ishlashi, shuningdek kasallikning oldini olish uchun kondensatning hajmini nazorat qilish kerak58,61.Bizning natijalarimiz aS/Tau tizimi uchun LLPS va LSPT o'rtasidagi muvozanatning muhimligini ham ta'kidlaydi.Tomchi hosil bo'lishi to'yinganlik sharoitida mavjud bo'lgan oqsil monomerlari miqdorini kamaytirish orqali amiloid agregatsiyasidan himoya qilishi mumkin bo'lsa-da, boshqa tizimlarda taklif qilinganidek63,64, yuqori tomchilar darajasida tomchilar sintezi sekin konformatsion qayta tartibga solish orqali ichki oqsil agregatsiyasiga olib kelishi mumkin.protein tarmoqlari..
Umuman olganda, bizning ma'lumotlarimiz LSPT kontekstida tushirish tarmoqlarida birlashtirilgan valentlik va qoniqarli/qoniqarsiz o'zaro ta'sirlarning dolzarbligini qattiq ta'kidlaydi.Xususan, biz toʻliq uzunlikdagi aS/Tau441 kondensatlari ikkala oqsilni oʻz ichiga olgan amiloidga oʻxshash heteroagregatlarni hosil qilish uchun samarali birlasha olishi va yadrolanishini koʻrsatamiz va tajribamiz natijalari asosida molekulyar mexanizmni taklif qilamiz.Biz bu erda xabar bergan aS/Tau suyuqligi koaservatidagi ikkita oqsilning birgalikda yig'ilishi haqiqatan ham kasallikning o'ziga xos belgilari bo'lgan qo'shimchalardagi ikkita oqsilning birgalikda lokalizatsiyasi bilan bog'liq bo'lishi mumkin va LLPS va LLPS o'rtasidagi munosabatlarni tushunishga yordam beradi. amiloid to'planishi, neyrodegeneratsiyada yuqori zaryadlangan IDPga yo'l ochadi.
Monomerik WT-aS, sistein mutantlari (Q24C-aS, N122C-aS) va DCt-aS variantlari (DA101-140) E. coli da ifodalangan va yuqorida tavsiflanganidek tozalangan.5 mM DTT disulfid bog'lanishini oldini olish uchun aS sistein mutantlarini tozalashning barcha bosqichlariga kiritilgan.Tau441 izoformasi (Adgene #16316 dan olingan plazmid), DNt-Tau varianti (D1–150, IVA ni CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTTCTTAAAGTTAAAC (G2TaTC-15) va Agg15 bilan klonlash orqali olingan. 5 primer) E. coli kulturalari edi 37 ° C va 180 rpm da OD600 = 0,6-0,7 gacha o'sdi va ifoda 37 ° C da 3 soat davomida IPTG bilan indüklendi.Hujayralarni 11500 xg da 4 °C da 15 daqiqa davomida yig'ib oling va 150 mM NaCl o'z ichiga olgan tuzli tampon bilan yuving.Pelletni lizis buferida qayta to'ldiring (1 L LB uchun 20 ml: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidin mkM10 mkm10p).Sonikatsiya bosqichi 10 ta impuls uchun 80% amplitudali muz ustida amalga oshirildi (1 daqiqa yoqilgan, 1 daqiqa o'chirilgan).Bir ultratovushda 60 ml dan oshmasligi kerak.E. coli lizatlari 20 daqiqa davomida 95 ° C da qizdirilgan, so'ngra muzda sovutilgan va 40 daqiqa davomida 127 000 × g sentrifuga qilingan.Aniqlangan supernatant 3,5 kDa membranaga (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Buyuk Britaniya) qo'llandi va 4 L dializ buferiga (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgM2, DTTm 2m) qarshi dializ qilindi. , PMSF 0,1 mM) 10 soat davomida.5 ml kation almashish ustuni (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, AQSh) muvozanat buferi (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PMSF, 01) bilan muvozanatlashtirildi.Tau lizat 0,22 mkm PVDF filtri orqali filtrlangan va 1 ml / min oqim tezligida ustunga AOK qilingan.Elutsiya bosqichma-bosqich amalga oshirildi, tau 15-30% elüsyon buferi (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF) bilan elutildi.Fraksiyalar SDS-PAGE tomonidan tahlil qilindi va kutilgan molekulyar og'irligi tau bo'lgan bitta bandni o'z ichiga olgan har qanday fraktsiyalar 10 kDa santrifüj filtri yordamida konsentratsiya qilindi va 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM va DTT 2 mM bo'lgan bufer bilan almashtirildi. oxirgi protein konsentratsiyasi 100 mkM edi.Keyin protein eritmasi 0,22 mkm PVDF filtridan o'tkazildi, tezda muzlatiladi va -80 ° C da saqlanadi.Protein K18 mehribonlik bilan professor Alberto Boffi tomonidan taqdim etilgan.Preparatning tozaligi SDS-PAGE va MALDI-TOF/TOF tomonidan tasdiqlangan >95% ni tashkil etdi.Turli sisteinlar kimyoviy jihatdan AlexaFluor488-maleimid (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) yoki TEMPOL-maleimid (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada) bilan belgilangan.absorbans va MALDI-TOF/TOF bilan tasdiqlangan.Tau441, DNt-Tau, AggDef-Tau va K18 xuddi shu protsedura bo'yicha Atto647N-maleimid (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germaniya) yordamida 191 va 322-pozitsiyalarda mahalliy sistein qoldiqlari bilan belgilandi.aS va Tau441 uchun har bir qoldiq uchun sof to'lov CIDER66 yordamida yaratilgan.
Qattiq poli-L-lizin (Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, AQSh yetkazib beruvchi NMR bo'yicha pLK DP 90-110) 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 dan 10 mM konsentratsiyada eritildi, jarayon 5 marta sonikatsiya qilindi. daqiqa ultratovushli suv hammomida va -20 ° C da saqlang.PEG-8, dekstran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, AQSh) va FITC-dekstran-500 (Sigma -Aldrich, Sant-Luis, MI, AQSh) suvda eriydi va LLPS buferida keng tarqalgan.Dializ ifloslantiruvchi tuzlarni olib tashlaydi.Keyin ular gözenek hajmi 0,22 mkm bo'lgan shpritsli filtr orqali filtrlangan va ularning konsentratsiyasi refraktometr yordamida hisoblangan (Mettler Toledo, Kolumbus, Ogayo, AQSh).LLPS namunalari xona haroratida quyidagi tartibda tayyorlandi: bufer va ekstruziya aralashtirildi va 1 mM tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP, Carbosynth, Compton, Buyuk Britaniya), 1 mM 2,2,2,2-(Etan- 1, 2-diildinitril) tetraasetik kislota (EDTA, karboksint) va 1% proteaz inhibitori aralashmasi (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptin 5 mM).Keyin aS va eritilgan polikatyonlar (pLK yoki Tau variantlari) qo'shiladi.Tioflavin-T vaqt seriyali tajribalari uchun (ThT, Carbosynth, Compton, Buyuk Britaniya) umumiy ThT kontsentratsiyasini aS kontsentratsiyasining yarmiga teng qilish uchun foydalaning.Namunalar bir hil bo'lishini ta'minlash uchun ularni yumshoq, lekin yaxshilab aralashtiring.Natijalar bo'limida tasvirlanganidek, har bir komponentning konsentratsiyasi tajribadan tajribaga o'zgarib turardi.Tajriba davomiyligi 4 soatdan oshganda azid 0,02% (w/v) konsentratsiyada ishlatilgan.LLPS namunalaridan foydalangan holda barcha tahlillar uchun aralashmani tahlil qilishdan oldin 5 daqiqa davomida muvozanatlashiga ruxsat bering.Yorug'likning tarqalishini tahlil qilish uchun 150 µl namunalar bog'lanmagan 96 quduqli mikroplastinkalarga (µClear®, qora, F-Bottom/Chimney Quduq, Greiner bio-one, Kremsmünster, Avstriya) yuklangan va yopishqoq plyonka bilan qoplangan.LLPlar CLARIOstar plastinka o'quvchi (BMG Labtech, Ortenberg, Germaniya) da eritmaning markazida 350 nm da absorbansni o'lchash orqali kuzatildi.Tajribalar 25 ° C da uch nusxada o'tkazildi va xatolar o'rtacha standart og'ish sifatida hisoblandi.Suyultirilgan faza namunani santrifüjlash va SDS-PAGE gel tahlili orqali aniqlandi va suyultirilgan va konsentrlangan fazalardagi aS fraktsiyasi turli LLPS eritmalarida aniqlandi.1 mkM AF488 etiketli aS ni o'z ichiga olgan 100 mkl LLPS namunasi yaxshilab aralashtirish va 30 daqiqa davomida 9600 × g santrifüjlash yo'li bilan tayyorlandi, shundan so'ng odatda cho'kma ko'rinib turardi.SDS-PAGE jeli yordamida oqsil miqdorini aniqlash uchun supernatantning eng yuqori 50 mkl ishlatilgan.Jellar ChemiDoc gel tasvirlash tizimi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, AQSH) yordamida AF488 filtrlari bilan skanerdan o‘tkazildi yoki Coomassie dog‘i bilan bo‘yalgan va tegishli filtrlar bilan vizuallashtirilgan.Olingan chiziqlar ImageJ versiyasi 1.53i (Milliy sog'liqni saqlash institutlari, AQSh) yordamida tahlil qilindi.Tajribalar o'xshash natijalarga ega bo'lgan ikki xil tajribada ikki nusxada o'tkazildi.
Odatda, 150 mkl namunalar bog'lanmagan 96 quduqli mikroplastinkalarga qo'llanilgan va xona haroratida Leica DMI6000B teskari mikroskopida (Leica Microsystems, Wetzlar, Germaniya) ko'rsatilgan.Spotli tajribalar uchun µ-Slide Angiogenesis plitalari (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germaniya) yoki 96-quduqli polistirolli mikroplastinkalar (Corning Costar Corp., Acton, Massachusets) ham ishlatilgan.Yoritish manbalari sifatida EL6000 halogen yoki simob metall halid lampalar ishlatilgan (mos ravishda BF/DIC va WF tasviri uchun).WF mikroskopiyasi uchun yorug'likni namunaga qaratish va uni yig'ish uchun 40x kattalashtirish havo ob'ektivi (Leica Microsystems, Germaniya) ishlatilgan.AF488 va ThT etiketli namunalar uchun standart GFP filtr to'plamlari, qo'zg'atuvchi va emissiya tarmoqli o'tkazuvchan filtrlari, mos ravishda 460-500 nm va 512-542 nm tarmoqli o'tkazuvchan filtrlari va 495 nm dikroik oyna bilan filtr qo'zg'atilishi va emissiyasi.Atto647N bilan belgilangan namunalar uchun mos ravishda 628-40 nm va 692-40 nm qo'zg'atuvchi va emissiya diapazonli filtrli Cy5 filtrlarining standart to'plami va 660 nm dikroik oyna ishlatilgan.BF va DIC mikroskoplari uchun bir xil aks ettirilgan yorug'lik yig'ish maqsadidan foydalaning.Yig'ilgan yorug'lik Leica DFC7000 CCD kamerasida (Leica Microsystems, Germaniya) yozib olingan.Ekspozitsiya vaqti BF va DIC mikroskopini ko'rish uchun 50 ms va WF mikroskopini ko'rish uchun 20-100 ms edi.Taqqoslash uchun, ThT bilan barcha tajribalar uchun ta'sir qilish vaqti 100 ms edi.Tomchilarning birlashishini ko'rish uchun vaqt oralig'ida tajribalar o'tkazildi, tasvirlar har 100 ms dan bir necha daqiqa davomida to'planadi.Rasmni tahlil qilish uchun ImageJ (NIH, AQSH) ishlatilgan.Tajribalar o'xshash natijalar bilan uch nusxada o'tkazildi.
Kolokalizatsiya tajribalari, FRAP va 3D rekonstruksiya qilish uchun tasvirlar Zeiss LSM 880 teskari konfokal mikroskopida ZEN 2 ko'k nashri (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germaniya) yordamida olingan.50 µl namunalar µ-Slide Angiogenesis Petri idishlariga qo‘llanildi (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germaniya), gidrofil polimer (ibiTreat) bilan ishlov berildi va 63 × moyga botirish ob'ektiviga o'rnatildi (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4) DICda).Tasvirlar 458 nm, 488 nm va 633 nm argon lazer chiziqlari yordamida 0,26 mkm/piksel o'lchamlari va 8 mks/piksel ta'sir qilish vaqti 470-600 nm2, 470-600-38 nm, qo'zg'alish va emissiyani aniqlash oynalari uchun olingan. va 638-755 nm mos ravishda ThT, AF488 va Atto647Nni ko'rish uchun ishlatilgan.FRAP tajribalari uchun har bir namunaning sekundiga 1 kadr tezlikda suratga olish tezligi qayd etilgan.Tajribalar bir xil natijalar bilan xona haroratida uch nusxada o'tkazildi.Barcha tasvirlar Zen 2 ko'k nashri dasturi yordamida tahlil qilindi (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germaniya).FRAP egri chiziqlari normallashtirildi, chizildi va OriginPro 9.1 yordamida Zen 2 yordamida tasvirlardan olingan intensivlik/vaqt ma'lumotlariga moslashtirildi.Qayta tiklash egri chiziqlari molekulyar diffuziyani hisobga olish uchun mono-eksponensial modelga o'rnatildi, qo'shimcha eksponensial atama sotib olishning sayqallash effektini hisobga oldi.Keyin biz D ni nominal oqartirish radiusi va Kang va boshqalar tenglamasida bo'lgani kabi oldindan aniqlangan tiklanish yarim umrini ishlatib hisobladik.5 35 ko'rsatilgan.
aS ning yagona sistein variantlari 24 (TEMPOL-24-aS) va 122 (TEMPOL-122-aS) pozitsiyalarida 4-gidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL) bilan sintez qilindi, mos ravishda.Spin Labeling EPR tajribalari uchun aS kontsentratsiyasi 100 mkM ga o'rnatildi va PEG konsentratsiyasi 15% (w/v) edi.Turli yig'ish sharoitlari uchun aS: pLK nisbati 1:10 ni tashkil etdi, aS: DNt-Tau va aS: Tau441 nisbatlari esa 1: 1 da saqlangan.To'planish bo'lmaganda majburiy titrlash tajribalari uchun TEMPOL-122-aS 50 mkM da saqlangan va polikatyonlar har bir shartni alohida tayyorlab, ortib borayotgan konsentratsiyalarda titrlangan.CW-EPR o'lchovlari mikroto'lqinli (SHF) ~ 9,7 gigagertsli chastotada ishlaydigan Bruker ER4118 SPT-N1 rezonatori bilan jihozlangan Bruker ELEXSYS E580 X diapazonli spektrometr yordamida amalga oshirildi.Harorat 25 ° C ga o'rnatildi va suyuq azotli kriostat tomonidan nazorat qilindi.Spektrlar to'yinmagan sharoitda 4 mVt quvvatda MVt quvvatda, modulyatsiya amplitudasi 0,1 mT va modulyatsiya chastotasi 100 kHzda olingan.Tau441 yoki DNt-Tau (dastlabki oqsil eritmalarida mavjud) bo'lgan namunalardagi qaytaruvchi moddalarning qoldiq kontsentratsiyasi tufayli namunalar orasidagi spin kontsentratsiyasidagi farqlarni va spinning mumkin bo'lgan qisqarishini oldini olish uchun spektral intensivliklar normallashtirildi.Berilgan g qiymatlari Matlab®67 da joriy qilingan Easyspin dasturi (v. 6.0.0-dev.34) yordamida amalga oshirilgan EPR spektral modellashtirish natijasida olingan.Ma'lumotlarni modellashtirish uchun bir/ikki komponentli izotropik modellar ishlatilgan.Barcha signallarni normallashtirgandan so'ng, qoldiqlar har bir simulyatsiyani mos keladigan eksperimental spektrdan ayirish yo'li bilan hisoblab chiqildi.Bog'lanish titrlash tahlili uchun polikationlarning aS ga ulanishini kuzatish uchun uchinchi bandning normallashtirilgan EPR spektrining ikkinchi bandiga nisbatan intensivligi (III/III) ishlatilgan.Dissotsiatsiya konstantasini (Kd) baholash uchun natijada olingan egri chiziq n ta bir xil va mustaqil bog'lanish joylarini nazarda tutuvchi taxminiy modelga o'rnatildi.
NMR spektroskopiyasi tajribalari krioprob va Z-gradient bilan jihozlangan Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spektrometri yordamida amalga oshirildi.Barcha tajribalar 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 da 130-207 mkM aS va mos keladigan aS/DNt-Tau va pLK ekvivalentlari yordamida amalga oshirildi va 15 ° C da bajarildi.LPSni NMR orqali kuzatish uchun oldindan aralashtirilgan namunalarga 10% PEG qo'shildi.Kimyoviy siljishning buzilish grafigi (1b-rasm) o'rtacha 1H va 15N kimyoviy siljishlarni ko'rsatadi.aS 2D1H-15N HSQC spektrlari oldingi topshiriq (BMRB yozuvi # 25227) asosida tayinlangan va HNCA, HNCO va CBCAcoNH 3D spektrlarini yozib olish va tahlil qilish orqali tasdiqlangan.13Ca va 13Cb kimyoviy siljishlari DNt-Tau yoki pLK ishtirokida ikkilamchi struktura tendentsiyalaridagi mumkin bo'lgan o'zgarishlarni o'lchash uchun 68-sonli tasodifiy lasan konformatsiyasidagi aS kimyoviy siljishlari bilan solishtirganda hisoblangan (Qo'shimcha rasm 5c).R1r stavkalari hsqctretf3gpsi tajribalarini (Bruker kutubxonasidan olingan) 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 va 800 ms kechikishlar bilan qayd etish orqali o'lchandi va eksponensial funktsiyalar har xil intensivlikdagi kechikishning eng yuqori darajasiga moslashtirildi. marta R1r va uning eksperimental noaniqligini aniqlash.
Ikki rangli vaqt bilan ajraladigan floresan mikroskopiya tajribalari vaqt bilan bog'liq bo'lgan yagona fotonni hisoblash (TCSPC) qurilmasi bilan tijorat vaqtli MT200 flüoresan konfokal mikroskopda (PicoQuant, Berlin, Germaniya) o'tkazildi.Lazer diodining boshi impulsli interleaved qo'zg'alishi (PIE) uchun ishlatiladi, nur bitta rejimli to'lqin yo'riqnomasidan o'tadi va 481 nm va 637 nm lazer chiziqlari uchun 10 dan 100 nVt gacha bo'lgan lazer quvvatiga sozlangan, dikroik oynadan keyin o'lchanadi.Bu fotonlarni teskari o'zgartirish, oqartirish va to'yinganlik ta'siridan qochib, optimal fotonlarni hisoblash tezligini ta'minlaydi.m-Slide angiogenez qoplamalari yoki plitalari (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germaniya) tuzatuvchi yoqali Super Apochromat 60x NA 1.2 linzalari (Olympus Life Sciences, Waltham, AQSH) orqali toʻgʻridan-toʻgʻri suvga choʻmdirildi.Asosiy nurni ajratuvchi sifatida 488/640 nm dikroik oyna (Semrock, Lake Forest, IL, AQSh) ishlatilgan.Fokuslanmagan radiatsiya diametri 50 mikron bo'lgan teshik bilan bloklanadi, so'ngra fokuslangan nurlanish 50/50 nurni ajratuvchi tomonidan 2 aniqlash yo'liga bo'linadi.Yashil bo'yoq uchun (AF488) 520/35 va qizil bo'yoq uchun (Atto647N) 690/70 (Atto647N) detektori oldida tarmoqli emissiya filtrlari (Semrock, Lake Forest, IL, AQSh) ishlatilgan.Yagona fotonli ko'chki diodlari (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italiya) detektor sifatida ishlatilgan.Ma'lumotlarni yig'ish va tahlil qilish sotuvda mavjud bo'lgan SymphoTime64 dasturiy ta'minoti (PicoQuant GmbH, Berlin, Germaniya) yordamida amalga oshirildi.
m-Slide angiogenez quduqlariga ellik mikrolitr LLPS namunalari qo'llanildi (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germaniya).Olingan tasvirlar to'xtatilgan tomchilar uchun optimal ob'ektiv ish masofasi uchun quduq tubidan 20 mkm yuqoriga va eksenel o'lchamlari kamida 0,25 mkm/piksel va kechikish vaqti 400 mkm/piksel bo'lgan raftlar va nuqtalar uchun ~1 mkm gacha yo'naltirilgan.Har bir kanal uchun o'rtacha fon signali intensivligi (PBG, o'rtacha + 2s) asosida intensivlik chegarasini qo'llash orqali ma'lumotlarni tanlang, shunda faqat suyuq oqsil tomchilari, raftlar yoki dog'lar tanlanadi, dispers fazadan har qanday mumkin bo'lgan kelib chiqishi filtrlanadi.Har bir kanalning har bir turining (t) umrini tahlil qilish uchun (yashil, AF488 uchun "g" va qizil, Atto647N uchun "r") biz tomchilar, raftlar yoki dog'lar bo'lgan qiziqish hududlarini (ROI) tanladik (qo'shimcha 1-rasm). ).8b) va ularni har bir kanalga ularning umr bo'yi parchalanishini (mos ravishda tomchilar, raftlar yoki dog'lar uchun tD, tR va tP, Qo'shimcha 8c-rasmga qarang) dumga mos tahlil va ikki komponentli parchalanish modelidan foydalangan holda olingan.t dan o'rtacha t.Ko'p eksponensial moslashish uchun juda kam foton ishlab chiqaradigan ROIlar tahlildan chiqarildi.Amaldagi kesishish raftlar va nuqtalar uchun <104 foton va tomchilar uchun 103 edi.Tomchilar pastki chegaraga ega, chunki yuqori intensivlik qiymatlari bilan parchalanish egri chiziqlarini olish qiyin, chunki tasvir maydonidagi tomchilar odatda kichikroq va kamroq bo'ladi.Fotonlarni to'plash chegarasidan yuqori bo'lgan ROI'lar (>500 son / pikselga o'rnatilgan) ham tahlil qilish uchun tashlandi.Qiziqarli hududdan olingan intensivlikning egri chizig'ini xizmat muddatining boshidan maksimal 90% intensivligi bilan (parchalanishning maksimal intensivligidan biroz keyin) moslang va minimal IRF shovqinini ta'minlang va shu bilan birga barcha intensivlikning pasayishi uchun bir xil bo'ling. sozlamalar Nisbatan vaqt oynasi Raftlar va dog'lar uchun 25 dan 50 gacha ROI va tomchilar uchun 15-25 ROI tahlil qilindi, kamida 3 ta mustaqil tajribadan yozib olingan 4 dan ortiq replikatsiyadan tanlangan tasvirlar.Ikki dumli t-testlari turlar yoki koaservat tizimlari o'rtasidagi statistik farqlarni baholash uchun ishlatilgan.Yaroqlilik muddatini (t) piksel bo'yicha tahlil qilish uchun har bir kanal uchun maydon bo'yicha umrning umumiy zaiflashuvi hisoblab chiqilgan va 2/3 komponentli eksponensial zaiflashuv modelining taxminiyligi o'tkazilgan.Har bir piksel uchun umr bo'yi susayishi oldindan hisoblangan t qiymatlari yordamida o'rnatildi, natijada psevdocolor FLIM mos tasvir paydo bo'ldi.Quyruqning ishlash muddati bir xil kanalning barcha tasvirlarida bir xil edi va har bir parchalanish ishonchli moslashishni ta'minlash uchun etarli fotonlarni ishlab chiqardi.FRET tahlili uchun piksellar 11 fotonning fon signalini (FBG) o'rtacha hisoblaydigan 100 fotonning pastroq intensivlik chegarasini qo'llash orqali tanlangan.Har bir kanalning floresan intensivligi eksperimental ravishda aniqlangan tuzatish omillari bilan tuzatildi: 69 spektral o'zaro bog'liqlik a 0,004, to'g'ridan-to'g'ri qo'zg'alish b 0,0305, aniqlash samaradorligi g 0,517.Keyin piksel darajasida FRET samaradorligi quyidagi tenglama yordamida hisoblanadi:
Bu erda FDD donor (yashil) kanalda kuzatilgan floresans intensivligi, FDA bilvosita qo'zg'alishda akseptor (qizil) kanalda kuzatilgan floresans intensivligi va FAA - to'g'ridan-to'g'ri qo'zg'alish ostida akseptor (qizil) kanalda kuzatilgan floresans intensivligi ( PIE).Kanalda lyuminestsent intensivlik impulslari kuzatiladi).
LLPS buferiga (yuqoridagidek to'ldirilgan) 25 mkM etiketsiz monomerik Tau441 (25 mkM aS bilan yoki bo'lmasdan) o'z ichiga olgan 100 µl LLPS reaksiya eritmalarini yopishtiruvchi folga bilan qoplangan 96 quduqli mikroplastinkalarga joylashtiring va tomchilar paydo bo'lishi WF mikroskopi tomonidan tekshirilgandan so'ng. muvozanatlash.10 daqiqa ichida.Xona haroratida 48 soatlik inkubatsiyadan so'ng, oqsilli raflar va dog'lar mavjudligi tasdiqlandi.Keyin suyuqlikni quduqlardan ehtiyotkorlik bilan olib tashlang, so'ngra 50 L dissotsiatsiya tamponini (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) qo'shing va 10 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.Yuqori tuz konsentratsiyasi LLPS qoldiq PEG tufayli takrorlanmasligini ta'minlaydi va faqat elektrostatik o'zaro ta'sir natijasida hosil bo'lgan mumkin bo'lgan oqsil birikmalari qismlarga bo'linadi.Keyin quduq tubi mikropipet uchi bilan ehtiyotkorlik bilan qirib tashlandi va hosil bo'lgan eritma bo'sh kuzatuv qudug'iga o'tkazildi.Namunalarni 50 mkM ThT bilan 1 soat davomida inkubatsiya qilgandan so'ng, ajratilgan dog'lar mavjudligi WF mikroskopi bilan tekshirildi.300 µl 70 mkM aS eritmasini pH 7,4, natriy azid 0,01% 37 °C da va 200 rpm tezlikda orbital shakerda 7 kun davomida inkubatsiya qilish orqali ultratovushli aS fibrillalarini tayyorlang.Keyin eritma 9600 × g da 30 daqiqa davomida santrifüj qilindi, pellet PBS pH 7.4 da qayta suspenziya qilindi va sonikatsiya qilindi (Vibra-Cell VC130 sonikatorida 1 daqiqa, 50% tsikl, 80% amplituda, Sonics, Nyuton, AQSh) fibril namunalari kichik fibrillalarning nisbatan bir xil o'lchamdagi taqsimlanishi bilan.
FCS/FCCS tahlili va ikki rangli tasodifni aniqlash (TCCD) PIE rejimidan foydalangan holda FLIM-FRET mikroskopiya tajribalari uchun ishlatiladigan bir xil MT200 vaqt bilan hal qilingan lyuminestsent konfokal mikroskopda (Pico-Quant, Berlin, Germaniya) amalga oshirildi.Ushbu tajribalar uchun lazer quvvati 6,0 mkVt (481 nm) va 6,2 mVt (637 nm) ga qo'shildi.Ushbu lazer quvvatlarining kombinatsiyasi optimal hisoblash tezligiga erishish va fotosuratlarni oqartirish va to'yinganlikdan qochish uchun ishlatiladigan ftoroforlar juftlari uchun o'xshash yorqinlikni yaratish uchun tanlangan.Ma'lumotlarni yig'ish va tahlil qilish sotuvda mavjud bo'lgan SymphoTime64 2.3 versiyasi (PicoQuant, Berlin, Germaniya) yordamida amalga oshirildi.
LLPS yordamida olingan izolyatsiyalangan aS/Tau agregatlarining namunalari izolyatsiya tamponida tegishli monomolekulyar kontsentratsiyaga suyultiriladi (odatda 1:500 suyultirish, chunki agregatlar koaservat namunalaridan ajratilganda allaqachon past konsentratsiyada bo'ladi).Namunalar to'g'ridan-to'g'ri 1 mg / ml konsentratsiyada BSA eritmasi bilan qoplangan qoplamalarga (Korning, AQSh) qo'llanildi.
Yashil va qizil kanallarda PIE-smFRET tahlili uchun monomerik hodisalar natijasida kelib chiqqan past intensivlikdagi signallarni filtrlash uchun 25 fotonli pastroq intensivlik chegarasi qo'llanildi (monomerlar izolyatsiyalangan agregatlarga nisbatan yig'ilgan namunalardan ko'proq ekanligini unutmang).Ushbu chegara tahlil uchun agregatlarni maxsus tanlash uchun sof monomer namunalarini tahlil qilish natijasida olingan monomerik aS ning o'rtacha intensivligidan besh baravar ko'p hisoblangan.PIE drayv sxemasi TSCPC ma'lumotlarini yig'ish bilan birgalikda fon va spektral o'zaro bog'lanishni bartaraf etishga yordam beradigan umr bo'yi tortish filtrini qo'llash imkonini berdi.Yuqoridagi chegaralar yordamida tanlangan olov intensivligi faqat buferli namunalarning intensivligi/binga nisbatan paydo bo'lish histogrammalaridan aniqlangan o'rtacha fon signali yordamida tuzatildi.Katta agregatlar bilan bog'langan portlashlar odatda vaqt oralig'ida (1 ms ga o'rnatiladi) bir nechta ketma-ket qutilarni egallaydi.Bunday hollarda maksimal quvvatli quti tanlangan.FRET va stoxiometrik tahlil uchun nazariy jihatdan aniqlangan gamma omil g (0,517) ishlatilgan.Spektral o'zaro bog'lanish va to'g'ridan-to'g'ri qo'zg'alish hissalari qo'zg'atuvchi lazer kuchida ahamiyatsiz (eksperimental tarzda aniqlanadi).Portlashda FRET ning samaradorligi va stoxiometriyasi quyidagicha hisoblanadi.