Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydigan brauzer versiyasidan foydalanmoqdasiz.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptlarsiz ko'rsatamiz.
Har bir slaydda uchta maqolani ko'rsatadigan slayderlar.Slaydlar boʻylab harakatlanish uchun “Orqaga” va “Keyingi” tugmalaridan yoki har bir slayd boʻylab harakatlanish uchun oxiridagi slaydni boshqarish tugmalaridan foydalaning.

317 zanglamas po'latdan yasalgan rulonli quvurlar etkazib beruvchilari

Zanglamaydigan po'latdan yasalgan materialning kimyoviy tarkibi jadvali

SPACA6 sperma bilan ifodalangan sirt oqsili bo'lib, sutemizuvchilar jinsiy ko'payishi paytida gametalarning sintezi uchun juda muhimdir.Ushbu asosiy rolga qaramay, SPACA6 ning o'ziga xos funktsiyasi yaxshi tushunilmagan.Biz SPACA6 ning hujayradan tashqari domenining kristall tuzilishini 2,2 Å o'lchamlari bilan aniqlaymiz, to'rt ipli to'plamdan va kvazi-moslashuvchan bog'lovchilar bilan birlashtirilgan Ig-ga o'xshash b-sendvichlardan tashkil topgan ikki domenli oqsilni aniqlaymiz.Ushbu tuzilma IZUMO1ga o'xshaydi, boshqa gameta sintezi bilan bog'liq protein, SPACA6 va IZUMO1 ni bu erda IST super oilasi deb ataladigan urug'lanish bilan bog'liq oqsillar superoilasining asoschilariga aylantiradi.IST superoilasi strukturaviy ravishda oʻzining oʻralgan toʻrt spiralli toʻplami va bir juft disulfid bilan bogʻlangan CXXC motiflari bilan belgilanadi.Inson proteomasini tuzilishga asoslangan AlphaFold qidiruvi ushbu super oilaning qo'shimcha oqsil a'zolarini aniqladi;ayniqsa, bu oqsillarning ko'pchiligi gametalarning sintezida ishtirok etadi.SPACA6 tuzilishi va uning IST superoilasining boshqa a'zolari bilan aloqasi sutemizuvchilar gametalarining sintezi haqidagi bilimimizda etishmayotgan bo'g'inni ta'minlaydi.
Har bir inson hayoti ikkita alohida gaploid gametadan boshlanadi: otaning spermasi va onaning tuxumi.Bu spermatozoidlar qizg'in tanlash jarayonining g'olibi bo'lib, unda millionlab sperma hujayralari ayol jinsiy yo'lidan o'tib, turli to'siqlarni yengib o'tadi1 va sig'imdan o'tadi, bu ularning harakatchanligini va sirt komponentlari jarayonini kuchaytiradi2,3,4.Sperma va oosit bir-birini topsa ham, jarayon hali tugamagan.Oosit hujayralar qatlami va zona pellucida deb ataladigan glikoprotein to'sig'i bilan o'ralgan bo'lib, tuxum hujayralariga kirish uchun sperma o'tishi kerak.Spermatozoidlar bu yakuniy to'siqlarni yengib o'tish uchun sirt yopishish molekulalari va membrana bilan bog'langan va ajralib chiqadigan fermentlarning kombinatsiyasidan foydalanadi5.Bu molekulalar va fermentlar asosan ichki membranada va akrosomal matritsada saqlanadi va akrosomal reaksiya jarayonida spermatozoidning tashqi membranasi parchalanganda aniqlanadi6.Ushbu shiddatli sayohatning yakuniy bosqichi sperma-tuxum sintezi hodisasidir, bunda ikkita hujayra membranalarini birlashtirib, bitta diploid organizmga aylanadi7.Garchi bu jarayon insonning ko'payishida yangi bo'lsa-da, zarur molekulyar o'zaro ta'sirlar yaxshi tushunilmagan.
Gametalarning urug'lanishi bilan bir qatorda, ikkita lipid ikki qavatining birlashishi kimyosi keng o'rganilgan.Umuman olganda, membrana sintezi energetik jihatdan noqulay jarayon bo'lib, oqsil katalizatoridan ikkita membranani bir-biriga yaqinlashtiradigan, ularning uzluksizligini buzadigan va sintezni keltirib chiqaradigan strukturaviy konformatsiya o'zgarishini talab qiladi8,9.Ushbu protein katalizatorlari fusogenlar sifatida tanilgan va son-sanoqsiz termoyadroviy tizimlarda topilgan.Ular virusning xost hujayralariga kirishi uchun zarur (masalan, OIV-1da gp160, koronaviruslarda spike, gripp viruslarida gemagglutinin)10,11,12 platsenta (sintsitin)13,14,15 va pastki eukaryotlarda gameta hosil qiluvchi birikmalar ( O'simliklar, protistlar va artropodlarda HAP2/GCS1) 16,17,18,19.Inson gametalari uchun fusogenlar hali kashf etilmagan, ammo bir nechta oqsillar gametalarning biriktirilishi va sintezi uchun juda muhim ekanligi ko'rsatilgan.Sichqoncha va inson gametalarining birlashishi uchun zarur bo'lgan transmembran oqsili bo'lgan oosit bilan ifodalangan CD9 birinchi bo'lib kashf etilgan 21,22,23.Uning aniq funktsiyasi noaniq bo'lib qolsa-da, yopishqoqlikdagi roli, tuxum mikrovilluslarida yopishish o'choqlarining tuzilishi va/yoki oosit yuzasi oqsillarining to'g'ri joylashishi 24,25,26 ko'rinadi.Gameta sintezi uchun juda muhim bo'lgan ikkita eng tipik oqsil sperma oqsili IZUMO127 va oosit oqsili JUNO28 bo'lib, ularning o'zaro birlashishi gametalarni aniqlash va sintezdan oldin yopishishda muhim qadamdir.Erkak Izumo1 nokaut sichqonlari va urg'ochi Juno nokaut sichqonlari butunlay sterildir, bu modellarda sperma perivitellin bo'shlig'iga kiradi, ammo gametalar birlashmaydi.Xuddi shunday, inson in vitro urug'lantirish tajribalarida gametalarga anti-IZUMO1 yoki JUNO27,29 antikorlari bilan ishlov berilganda qo'shilish kamayadi.
Yaqinda IZUMO1 va JUNO20, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ga fenotipik o'xshash sperma bilan ifodalangan oqsillarning yangi kashf etilgan guruhi topildi.Sperma akrosomal membranasi bilan bog'langan protein 6 (SPACA6) keng miqyosli sichqoncha mutagenezini o'rganishda urug'lantirish uchun zarur ekanligi aniqlangan.Transgenning Spaca6 geniga kiritilishi erimaydigan spermatozoidlarni hosil qiladi, garchi bu spermatozoidlar perivitellin bo'shlig'iga 36 infiltratsiya qilsa.Sichqonlarda keyingi nokaut tadqiqotlari 30,32 gamet sintezi uchun Spaca6 zarurligini tasdiqladi.SPACA6 deyarli faqat moyaklar ichida namoyon bo'ladi va IZUMO1 ga o'xshash lokalizatsiya naqshiga ega, ya'ni akrosomal reaktsiyadan oldin spermatozoidlarning intimasi ichida, so'ngra akrosomal reaktsiyadan so'ng ekvatorial hududga o'tadi 30,32.Spaca6 homologlari turli xil sutemizuvchilar va boshqa eukaryotlarda mavjud 30 va uning inson gametalari sintezi uchun ahamiyati SPACA6 30 ga qarshilik ko'rsatish orqali in vitro inson urug'lantirilishini inhibe qilish orqali ko'rsatildi.IZUMO1 va JUNO-dan farqli o'laroq, SPACA6 tuzilishi, o'zaro ta'siri va funktsiyasi tafsilotlari noaniqligicha qolmoqda.
Oilani rejalashtirish va tug'ilishni davolashda kelajakdagi o'zgarishlar haqida ma'lumot berishga imkon beradigan inson spermatozoidlari va tuxumlarining sintezi asosidagi asosiy jarayonni yaxshiroq tushunish uchun biz SPACA6 tarkibiy va biokimyoviy tadqiqotlarini o'tkazdik.SPACA6 hujayradan tashqari domenining kristall tuzilishi to'rtta spiralli to'plamni (4HB) va kvazi-egiluvchan hududlar bilan bog'langan immunoglobulinga o'xshash (Ig-o'xshash) domenni ko'rsatadi.Oldingi tadqiqotlarda bashorat qilinganidek, 7,32,37 SPACA6 ning domen tuzilishi inson IZUMO1 ga oʻxshaydi va ikkita oqsil noodatiy motivga ega: uchburchak spiral yuzasiga ega 4HB va bir juft disulfid bilan bogʻlangan CXXC motivlari.Biz IZUMO1 va SPACA6 endi gameta sintezi bilan bog'liq bo'lgan kattaroq, tarkibiy jihatdan bog'liq bo'lgan oqsillarning super oilasini aniqlashni taklif qilamiz.Superoilaga xos xususiyatlardan foydalanib, biz AlphaFold strukturaviy inson proteomasini toʻliq izlab, ushbu super oilaning qoʻshimcha aʼzolarini, shu jumladan gametalar sintezi va/yoki urugʻlanishda ishtirok etgan bir nechta aʼzolarni aniqladik.Endi gameta sintezi bilan bog'liq bo'lgan umumiy strukturaviy qatlam va oqsillarning superfamiliyasi mavjudligi ko'rinadi va bizning strukturamiz inson gametalari sintezi mexanizmining ushbu muhim jihatining molekulyar xaritasini taqdim etadi.
SPACA6 - bu bitta N-bog'langan glikan va oltita taxminiy disulfid bog'lari bo'lgan bir o'tishli transmembran oqsili (S1a va S2-rasmlar).Biz Drosophila S2 hujayralarida inson SPACA6 (qoldiqlar 27-246) ning hujayradan tashqari domenini ifodaladik va nikel yaqinligi, kation almashinuvi va o'lchamni istisno qilish xromatografiyasi yordamida oqsilni tozaladik (S1b-rasm).Tozalangan SPACA6 ektodomani juda barqaror va bir hil.Ko'pburchakli yorug'lik tarqalishi (SEC-MALS) bilan birlashtirilgan o'lchamni istisno qilish xromatografiyasidan foydalangan holda tahlil 26,2 ± 0,5 kDa hisoblangan molekulyar og'irligi bo'lgan bitta cho'qqini aniqladi (S1c-rasm).Bu SPACA6 monomer ektodomenining o'lchamiga mos keladi, bu tozalash jarayonida oligomerizatsiya sodir bo'lmaganligini ko'rsatadi.Bundan tashqari, dumaloq dikroizm (CD) spektroskopiyasi erish nuqtasi 51,3 ° C bo'lgan aralash a/b strukturani aniqladi (S1d, e-rasm).CD spektrlarining dekonvolyutsiyasi 38,6% a-spiral va 15,8% b-torchali elementlarni aniqladi (S1d-rasm).
SPACA6 ektodomani tasodifiy matritsa ekish38 yordamida kristallangan bo'lib, natijada 2,2 Å o'lchamdagi ma'lumotlar to'plami (1-jadval va S3-rasm).Strukturani aniqlash uchun fragmentga asoslangan molekulyar almashtirish va SAD bosqichma-bosqich ma'lumotlarning bromid ta'siri bilan kombinatsiyasidan foydalangan holda (1-jadval va S4-rasm), yakuniy tozalangan model 27-246 qoldiqlaridan iborat.Tuzilish aniqlangan vaqtda eksperimental yoki AlphaFold tuzilmalari mavjud emas edi.SPACA6 ektodomenining oʻlchami 20 Å × 20 Å × 85 Å boʻlib, yettita spiral va toʻqqizta b ipdan iborat boʻlib, oltita disulfid bogʻlari bilan barqarorlashgan choʻzilgan uchinchi darajali burmaga ega (1a, b-rasm).Asn243 yon zanjirining oxiridagi zaif elektron zichligi bu qoldiqning N-bog'langan glikozillanish ekanligini ko'rsatadi.Struktura ikkita domendan iborat: N-terminal to'rt spiralli to'plam (4HB) va ular orasida oraliq ilgak mintaqasi bo'lgan C-terminal Ig-ga o'xshash domen (1c-rasm).
SPACA6 hujayradan tashqari domenining tuzilishi.SPACA6 hujayradan tashqari domenining chiziqli diagrammasi, N dan C-terminusgacha bo'lgan zanjirning rangi quyuq ko'kdan to'q qizil ranggacha.Disulfid aloqalarida ishtirok etadigan sisteinlar qizil rangda ta'kidlangan.b SPACA6 ning hujayradan tashqari domen topologiyasi.1a-rasmdagi kabi bir xil rang sxemasidan foydalaning.c SPACA6 hujayradan tashqari domen.4HB, menteşe va Ig-ga o'xshash domen diagrammalari mos ravishda to'q sariq, yashil va ko'k rangga ega.Qatlamlar masshtabga tortilmaydi.
SPACA6 ning 4HB domeni to'rtta asosiy spiralni (1-4 spiral) o'z ichiga oladi, ular spiral spiral shaklida joylashgan (2a-rasm), antiparallel va parallel o'zaro ta'sirlar o'rtasida almashinadi (2b-rasm).Kichkina qo'shimcha bir burilishli spiral (spiral 1') to'plamga perpendikulyar yotqizilgan bo'lib, 1 va 2 spiralli uchburchakni hosil qiladi. Bu uchburchak 3 va 4 ning nisbatan zich o'ramining spiral-burchak o'rashida biroz deformatsiyalangan. 2a-rasm).
4HB N-terminal chiziqli diagrammasi.b to'rtta spiral to'plamining yuqoridan ko'rinishi, har bir spiral N-terminusda to'q ko'k va C-uchida to'q qizil rang bilan belgilangan.c 4HB uchun yuqoridan pastga spiral g'ildirak diagrammasi, har bir qoldiq bir harfli aminokislotalar kodi bilan belgilangan doira shaklida ko'rsatilgan;faqat g'ildirakning yuqori qismidagi to'rtta aminokislotalar raqamlangan.Qutb bo'lmagan qoldiqlar sariq rangga, qutbsiz zaryadsiz qoldiqlar yashil rangga, musbat zaryadlangan qoldiqlar ko'k rangga va manfiy zaryadlangan qoldiqlar qizil rangga ega.d 4HB domenining uchburchak yuzlari, 4HBs to'q sariq rangda va ilgaklar yashil rangda.Ikkala qo'shimchada novda shaklidagi disulfid aloqalari mavjud.
4HB asosan alifatik va aromatik qoldiqlardan tashkil topgan ichki hidrofobik yadroda to'plangan (2c-rasm).Yadroda Cys41 va Cys55 o'rtasida disulfid bog'i mavjud bo'lib, u 1 va 2 spirallarni yuqori ko'tarilgan uchburchakda bir-biriga bog'laydi (2d-rasm).Helix 1 'dagi CXXC motivi va menteşe mintaqasidagi b-soch tolasining uchida topilgan boshqa CXXC motivi o'rtasida ikkita qo'shimcha disulfid aloqasi hosil bo'ldi (2d-rasm).Noma'lum funktsiyaga ega konservativ arginin qoldig'i (Arg37) 1', 1 va 2 spirallardan hosil bo'lgan ichi bo'sh uchburchak ichida joylashgan. Alifatik uglerod atomlari Cb, Cg va Cd Arg37 hidrofobik yadro bilan o'zaro ta'sir qiladi va uning guanidin guruhlari tsiklik ravishda harakatlanadi. Thr32 magistral va yon zanjir o'rtasidagi o'zaro ta'sirlar orqali 1' va 1 spirallar o'rtasida (rasm S5a, b).Tyr34 ikkita kichik bo'shliqni qoldirib, bo'shliqqa cho'ziladi, ular orqali Arg37 erituvchi bilan o'zaro ta'sir qilishi mumkin.
Ig-ga o'xshash b-sendvich domenlari gidrofobik yadro orqali o'zaro ta'sir qiluvchi ikki yoki undan ortiq ko'p tarmoqli amfipatik b-varaqlarning umumiy xususiyatiga ega bo'lgan oqsillarning katta superfamiliyasidir. va ikki qatlamdan iborat (S6a-rasm).1-varaq to'rt ipdan (D, F, H va I iplar) iborat b-varaq bo'lib, bunda F, H va I iplar antiparallel joylashishni hosil qiladi va I va D iplar parallel o'zaro ta'sir o'tkazadi.2-jadval - kichik anti-parallel ikki torli beta varaq (E va G iplari).E zanjirining C-terminusi va H zanjirining markazi (Cys170-Cys226) o'rtasida ichki disulfid bog'lanish kuzatildi (S6b-rasm).Bu disulfid bog'lanish immunoglobulinning b-sendvich domenidagi disulfid bog'lanishiga o'xshaydi40,41.
To'rt ipli b-varaq butun uzunligi bo'ylab buralib, shakli va elektrostatikasi bilan farq qiluvchi assimetrik qirralarni hosil qiladi.Yupqaroq chekka SPACA6 da qolgan notekis va elektrostatik jihatdan xilma-xil sirtlarga nisbatan ajralib turadigan tekis hidrofobik atrof-muhit yuzasi (S6b, c-rasm).Hidrofobik sirtni ta'sirlangan magistral karbonil/amino guruhlari va qutb yon zanjirlari halosi o'rab oladi (S6c-rasm).Kengroq chegara hidrofobik yadroning N-terminal qismini to'sib qo'yadigan va F zanjiri magistralining ochiq qutbli guruhi bilan uchta vodorod aloqasini hosil qiluvchi qopqoqli spiral segment bilan qoplangan (S6d-rasm).Ushbu chekkaning C-terminal qismi qisman ochiq hidrofobik yadroli katta cho'ntak hosil qiladi.Cho'ntak uchta juft arginin qoldiqlari (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 va Arg212-Arg214) va markaziy histidin (His220) tufayli musbat zaryadlar bilan o'ralgan (S6e-rasm).
Menteşe mintaqasi spiral domen va Ig o'xshash domen o'rtasidagi qisqa segment bo'lib, bitta antiparallel uch ipli b-qatlam (A, B va C iplar), kichik 310 spiral va bir nechta uzun tasodifiy spiral segmentlardan iborat.(S7-rasm).Menteşe mintaqasidagi kovalent va elektrostatik kontaktlar tarmog'i 4HB va Ig-ga o'xshash domen o'rtasidagi yo'nalishni barqarorlashtiradigan ko'rinadi.Tarmoqni uch qismga bo'lish mumkin.Birinchi qism ikkita CXXC naqshini (27CXXC30 va 139CXXC142) o'z ichiga oladi, ular menteşadagi b-soch tolasi va 4HB da 1' spiral o'rtasida bir juft disulfid bog'lanish hosil qiladi.Ikkinchi qism Ig-ga o'xshash domen va menteşe o'rtasidagi elektrostatik shovqinlarni o'z ichiga oladi.Menteşadagi Glu132 Ig-ga o'xshash domenda Arg233 va menteşadagi Arg135 bilan tuz ko'prigi hosil qiladi.Uchinchi qism Ig-ga o'xshash domen va menteşe mintaqasi o'rtasidagi kovalent bog'lanishni o'z ichiga oladi.Ikki disulfid aloqasi (Cys124-Cys147 va Cys128-Cys153) menteşe halqasini Gln131 va magistral funktsional guruh o'rtasidagi elektrostatik o'zaro ta'sirlar bilan barqarorlashtirilgan bog'lovchiga bog'laydi va birinchi Ig-ga o'xshash domenga kirish imkonini beradi.zanjir.
SPACA6 ektodomenining tuzilishi va 4HB va Ig-ga o'xshash domenlarning alohida tuzilmalari protein ma'lumotlar bazalarida 42 tizimli o'xshash yozuvlarni qidirish uchun ishlatilgan.Biz yuqori Dali Z ballari, kichik standart og'ishlar va katta LALI ballari (ikkinchisi - tizimli ekvivalent qoldiqlar soni) bo'lgan o'yinlarni aniqladik.To'liq ektodomen qidiruvining dastlabki 10 tasi (S1-jadval) qabul qilinadigan Z balli > 842 bo'lsa-da, faqat 4HB yoki Ig-ga o'xshash domenni qidirish bu xitlarning aksariyati faqat b-sendvichlarga to'g'ri kelishini ko'rsatdi.ko'p oqsillarda topilgan hamma joyda joylashgan burma.Dali-dagi barcha uchta qidiruv faqat bitta natijani berdi: IZUMO1.
Uzoq vaqt davomida SPACA6 va IZUMO1 tuzilmaviy o'xshashliklari borligi taxmin qilingan7,32,37.Ushbu ikkita gameta sintezi bilan bog'liq bo'lgan oqsillarning ektodomenlari atigi 21% ketma-ketlikni taqsimlaydi (S8a-rasm), SPACA6-da saqlangan disulfid bog'lanish namunasi va prognoz qilingan C-terminal Ig-ga o'xshash domenni o'z ichiga olgan murakkab dalillar, dastlabki urinishlarni yaratishga imkon berdi. Shablon sifatida IZUMO1 dan foydalangan holda A va SPACA6 sichqonchasining gomologik modeli37.Bizning tuzilmamiz bu bashoratlarni tasdiqlaydi va o'xshashlikning haqiqiy darajasini ko'rsatadi.Aslida, SPACA6 va IZUMO137,43,44 tuzilmalari bir xil ikki domenli arxitekturani (S8b-rasm) o'xshash 4HB va Ig-ga o'xshash b-sendvich domenlari bilan menteşe mintaqasi bilan bog'laydi (S8c-rasm).
IZUMO1 va SPACA6 4HB an'anaviy spiral to'plamlardan umumiy farqlarga ega.Odatda 4HBs, 45,46 endosoma sintezida ishtirok etgan SNARE oqsil komplekslarida topilganlar kabi, markaziy o'q atrofida doimiy egrilikni saqlaydigan bir xil masofada joylashgan spirallarga ega 47. Bundan farqli o'laroq, IZUMO1 va SPACA6 da spiral domenlar buzilgan, o'zgaruvchan egrilik va notekis qadoqlash (S8d-rasm).Ehtimol, 1′, 1 va 2 spirallar tomonidan hosil qilingan uchburchak tufayli yuzaga kelgan burma IZUMO1 va SPACA6 da saqlanadi va 1′ spiraldagi bir xil CXXC motivi bilan barqarorlashtiriladi.Biroq, SPACA6 da topilgan qo'shimcha disulfid bog'lanishi (yuqoridagi 1 va 2 spirallarni kovalent bog'lovchi Cys41 va Cys55) uchburchak cho'qqisida keskinroq cho'qqi hosil qiladi, bu esa SPACA6 ni IZUMO1 dan ko'ra ko'proq burilish qiladi va aniqroq bo'shliq uchburchaklari bilan.Bundan tashqari, IZUMO1da SPACA6 da ushbu bo'shliqning markazida kuzatilgan Arg37 yo'q.Bundan farqli o'laroq, IZUMO1 alifatik va aromatik qoldiqlarning ko'proq tipik hidrofobik yadrosiga ega.
IZUMO1 ikki va besh qatorli b-varaqdan iborat Ig-ga o'xshash domenga ega43.IZUMO1 dagi qo'shimcha ip SPACA6 dagi lasan o'rnini bosadi, u ipdagi magistral vodorod aloqalarini cheklash uchun F ip bilan o'zaro ta'sir qiladi.Taqqoslashning qiziqarli nuqtasi bu ikkita oqsilning Ig-ga o'xshash domenlarining prognoz qilingan sirt zaryadidir.IZUMO1 yuzasi SPACA6 yuzasiga qaraganda ko'proq manfiy zaryadlangan.Qo'shimcha zaryad sperma membranasiga qaragan C-terminus yaqinida joylashgan.SPACA6 da xuddi shu hududlar neytralroq yoki musbat zaryadlangan edi (S8e-rasm).Masalan, SPACA6 dagi hidrofobik sirt (ingichkaroq qirralar) va musbat zaryadlangan chuqurlar (kengroq qirralar) IZUMO1 da manfiy zaryadlangan.
IZUMO1 va SPACA6 o'rtasidagi munosabatlar va ikkilamchi tuzilish elementlari yaxshi saqlangan bo'lsa-da, Ig-ga o'xshash domenlarning strukturaviy moslashuvi ikkala domenning bir-biriga nisbatan umumiy yo'nalishi bo'yicha farq qilishini ko'rsatdi (S9-rasm).IZUMO1 spiral to'plami b-sendvich atrofida egilib, markaziy o'qdan taxminan 50 ° burchak ostida ilgari tasvirlangan "bumerang" shaklini yaratadi.Bundan farqli o'laroq, SPACA6 da spiral nur teskari yo'nalishda taxminan 10 ° egilgan.Ushbu yo'nalishlardagi farqlar, ehtimol, menteşe mintaqasidagi farqlarga bog'liq.Birlamchi ketma-ketlik darajasida IZUMO1 va SPACA6 sistein, glitsin va aspartik kislota qoldiqlari bundan mustasno, menteşada bir oz ketma-ketlik o'xshashligiga ega.Natijada, vodorod aloqalari va elektrostatik tarmoqlar butunlay boshqacha.b-varaqning ikkilamchi strukturasi elementlari IZUMO1 va SPACA6 tomonidan taqsimlanadi, garchi IZUMO1dagi zanjirlar ancha uzunroq va 310 spiral (5 spiral) SPACA6 uchun xosdir.Ushbu farqlar ikkita boshqa o'xshash oqsil uchun turli xil domen yo'nalishlariga olib keladi.
Dali serverimizdagi qidiruvimiz shuni ko'rsatdiki, SPACA6 va IZUMO1 faqat ikkita eksperimental tarzda aniqlangan tuzilmalar bo'lib, oqsillar bazasida saqlanadi, ularda 4HB katlami mavjud (jadval S1).Yaqinda DeepMind (Alphabet/Google) birlamchi ketma-ketliklardan oqsillarning 3D tuzilmalarini aniq bashorat qila oladigan neyron tarmoqqa asoslangan AlphaFold tizimini ishlab chiqdi48.SPACA6 tuzilishini hal qilganimizdan ko'p o'tmay, AlphaFold ma'lumotlar bazasi chiqarildi, u inson proteomidagi barcha oqsillarning 98,5% ni qamrab oluvchi prognozli tuzilma modellarini taqdim etdi48,49.Qidiruv modeli sifatida hal qilingan SPACA6 tuzilmasidan foydalanib, AlphaFold inson proteomasidagi model uchun tizimli homologik qidiruv SPACA6 va IZUMO1 bilan mumkin bo'lgan tarkibiy o'xshashliklarga ega nomzodlarni aniqladi.AlphaFold-ning SPACA6-ni bashorat qilishda (S10a-rasm) aql bovar qilmaydigan aniqligini, ayniqsa, bizning hal qilingan tuzilmamiz bilan solishtirganda 1,1 Å rms ektodomenini (rasm S10b) hisobga olsak, aniqlangan SPACA6 mosliklari aniq bo'lishi mumkinligiga amin bo'lishimiz mumkin.
Ilgari PSI-BLAST sperma bilan bog'liq bo'lgan boshqa uchta oqsil: IZUMO2, IZUMO3 va IZUMO450 bilan IZUMO1 klasterini qidirdi.AlphaFold prognoziga ko'ra, bu IZUMO oilasi oqsillari IZUMO1 (3a va S11-rasmlar) bilan bir xil disulfid bog'lanish namunasi bilan 4HB domeniga birikadi, garchi ularda Igga o'xshash domen yo'q.Taxminlarga ko'ra, IZUMO2 va IZUMO3 IZUMO1 ga o'xshash bir tomonlama membrana oqsillari, IZUMO4 esa ajralib chiqadigan ko'rinadi.Gameta sintezidagi IZUMO 2, 3 va 4 oqsillarining vazifalari aniqlanmagan.IZUMO3 spermatozoidlarning rivojlanishida akrozoma biogenezida rol o'ynashi ma'lum51 va IZUMO oqsili kompleks hosil qiladi50.Sutemizuvchilar, sudraluvchilar va amfibiyalarda IZUMO oqsillarining saqlanishi ularning potentsial funktsiyasi DCST1/2, SOF1 va FIMP kabi boshqa ma'lum gametalar sintezi bilan bog'liq bo'lgan oqsillar bilan mos kelishini ko'rsatadi.
IST superoilasi domen arxitekturasining diagrammasi, mos ravishda to'q sariq, yashil va ko'k ranglarda ta'kidlangan 4HB, menteşe va Ig-ga o'xshash domenlar.IZUMO4 qora ko'rinadigan noyob C-terminal hududiga ega.Tasdiqlangan va taxminiy disulfid aloqalari mos ravishda qattiq va nuqtali chiziqlar bilan ko'rsatilgan.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1Zold (TMEMAl8LA) va JB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) A paneli bilan bir xil rang diapazonida ko‘rsatiladi. Disulfid bog‘lanishlari to‘q qizil rangda ko‘rsatilgan.TMEM95, IZUMO2 va IZUMO3 transmembran spirallari ko'rsatilmagan.
IZUMO oqsilidan farqli o'laroq, boshqa SPACA oqsillari (ya'ni, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 va SPACA9) SPACA6 dan tizimli ravishda farq qiladi (S12-rasm).Faqat SPACA9 4HB ga ega, lekin u SPACA6 bilan bir xil parallel-parallel orientatsiya yoki bir xil disulfid aloqasiga ega bo'lishi kutilmaydi.Faqat SPACA1 o'xshash Ig-ga o'xshash domenga ega.AlphaFold SPACA3, SPACA4 va SPACA5 SPACA6 dan butunlay boshqacha tuzilishga ega ekanligini taxmin qiladi.Qizig'i shundaki, SPACA4 urug'lanishda ham rol o'ynashi ma'lum, ammo SPACA6 ga qaraganda ko'proq darajada, buning o'rniga sperma va oosit zonasi pellucida52 o'rtasidagi o'zaro ta'sirni osonlashtiradi.
Bizning AlphaFold qidiruvimiz IZUMO1 va SPACA6 4HB, TMEM95 uchun boshqa moslikni topdi.TMEM95, bitta spermatozoidga xos transmembran oqsili, 32,33 ablatsiya qilinganida erkak sichqonlarni bepusht qiladi.TMEM95 ga ega boʻlmagan spermatozoidlar normal morfologiyasi, harakatchanligi va zona pellucida ichiga kirib, tuxum pardasi bilan bogʻlanish qobiliyatiga ega boʻlgan, lekin tuxumdon pardasi bilan birlasha olmagan.Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, TMEM95 IZUMO133 bilan tarkibiy o'xshashliklarga ega.Haqiqatan ham, AlphaFold modeli TMEM95 IZUMO1 va SPACA6 kabi bir xil juft CXXC naqshlari va SPACA6 da topilgan 1 va 2 spirallar orasidagi bir xil qo'shimcha disulfid bog'lanishiga ega 4HB ekanligini tasdiqladi (3a va S11-rasm).TMEM95da Ig-ga o'xshash domen bo'lmasa-da, u SPACA6 va IZUMO1 menteşe mintaqalariga o'xshash disulfid bog'lanish naqshiga ega bo'lgan hududga ega (3b-rasm).Ushbu qo'lyozma nashr etilganda, nashrdan oldingi server AlphaFold53 natijasini tasdiqlovchi TMEM95 tuzilishi haqida xabar berdi.TMEM95 SPACA6 va IZUMO1 ga juda o'xshaydi va evolyutsion tarzda allaqachon amfibiyalarda saqlanib qolgan (4-rasm va S13).
PSI-BLAST qidiruvi ushbu ketma-ketliklarning hayot daraxtidagi o'rnini aniqlash uchun NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP va SOF1 ma'lumotlar bazalaridan foydalangan.Filial nuqtalari orasidagi masofalar masshtabda ko'rsatilmaydi.
SPACA6 va IZUMO1 o'rtasidagi ajoyib umumiy tizimli o'xshashlik ular TMEM95 va IZUMO 2, 3 va 4 oqsillarini o'z ichiga olgan saqlanib qolgan strukturaviy superoilaning asoschilari ekanligini ko'rsatadi.ma'lum a'zolar: IZUMO1, SPACA6 va TMEM95.Faqat bir nechta a'zolar Ig-ga o'xshash domenlarga ega bo'lganligi sababli, IST super oilasining o'ziga xos belgisi 4HB domeni bo'lib, bu barcha oqsillarga xos bo'lgan o'ziga xos xususiyatlarga ega: 1) Antiparallel/parallel almashinishda joylashgan spirallar bilan o'ralgan 4HB (1-rasm). 5a), 2) to‘plamning uchburchak yuzi bo‘lib, to‘plam ichidagi ikkita spiral va uchinchi vertikal spiraldan iborat (rasm. kalit sohasi (5c-rasm). Tioredoksinga o‘xshash oqsillarda topilgan CXXC motivi ma’lumki, o‘z vazifasini bajaradi. redoks sensori sifatida 54,55,56 , IST oila a'zolaridagi motiv esa gameta sintezidagi ERp57 kabi protein disulfid izomerazalari bilan bog'lanishi mumkin.Rollar bog'langan 57,58.
IST superoilasi a'zolari 4HB domenining uchta xarakterli xususiyati bilan belgilanadi: parallel va antiparallel orientatsiya o'rtasida almashinadigan to'rtta spiral, uchburchak spiral to'plam yuzlari va kichik molekulalar orasida hosil bo'lgan ca CXXC qo'sh motivi.) N-terminal spirallari (to'q sariq) va menteşe mintaqasi b-soch tolasi (yashil).
SPACA6 va IZUMO1 o'rtasidagi o'xshashlikni hisobga olgan holda, birinchisining IZUMO1 yoki JUNO bilan bog'lanish qobiliyati sinovdan o'tkazildi.Biolayer interferometriyasi (BLI) kinetik asoslangan bog'lash usuli bo'lib, u ilgari IZUMO1 va JUNO o'rtasidagi o'zaro ta'sirni miqdoriy aniqlash uchun ishlatilgan.JUNO analitining yuqori konsentratsiyasiga ega yem sifatida IZUMO1 bilan biotin yorliqli sensorni inkubatsiya qilgandan so'ng, kuchli signal aniqlandi (S14a-rasm), bu sensor uchiga biriktirilgan biomaterialning qalinligida bog'lanish bilan bog'liq o'zgarishlarni ko'rsatadi.Shunga o'xshash signallar (ya'ni, IZUMO1 analitiga qarshi o'lja sifatida sensorga ulangan JUNO) (S14b-rasm).SPACA6 sensor bilan bog'langan IZUMO1 yoki sensor bilan bog'langan JUNO ga qarshi tahlil qiluvchi sifatida ishlatilganda hech qanday signal aniqlanmadi (rasm S14a, b).Ushbu signalning yo'qligi SPACA6 ning hujayradan tashqari domeni IZUMO1 yoki JUNO ning hujayradan tashqari domeni bilan o'zaro ta'sir qilmasligini ko'rsatadi.
BLI tahlili o'lja oqsilidagi erkin lizin qoldiqlarining biotinilatsiyasiga asoslanganligi sababli, bu modifikatsiya lizin qoldiqlari o'zaro ta'sirda ishtirok etsa, bog'lanishni oldini oladi.Bundan tashqari, ulanishning sensorga nisbatan yo'nalishi sterik to'siqlarni keltirib chiqarishi mumkin, shuning uchun an'anaviy pastga tushirish tahlillari rekombinant SPACA6, IZUMO1 va JUNO ektodomenlarida ham amalga oshirildi.Shunga qaramay, SPACA6 His-belgilangan IZUMO1 yoki His-belgilangan JUNO (S14c,d-rasm) bilan cho'kmagan, bu BLI tajribalarida kuzatilganiga mos keladigan o'zaro ta'sirni ko'rsatmaydi.Ijobiy nazorat sifatida biz JUNO ning His IZUMO1 yorlig'i bilan o'zaro ta'sirini tasdiqladik (S14e va S15 rasmlar).
SPACA6 va IZUMO1 o'rtasidagi tizimli o'xshashlikka qaramay, SPACA6 ning JUNO ni bog'lay olmasligi ajablanarli emas.Inson IZUMO1 yuzasida JUNO bilan o'zaro ta'sir qiluvchi 20 dan ortiq qoldiqlar mavjud, shu jumladan uchta hududning har biridagi qoldiqlar (garchi ularning aksariyati menteşe hududida joylashgan bo'lsa ham) (S14f-rasm).Ushbu qoldiqlardan faqat bittasi SPACA6 (Glu70) da saqlanadi.Ko'pgina qoldiq almashtirishlar asl biokimyoviy xususiyatlarini saqlab qolgan bo'lsa-da, IZUMO1dagi muhim Arg160 qoldig'i SPACA6 da manfiy zaryadlangan Asp148 bilan almashtirildi;oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, IZUMO1dagi Arg160Glu mutatsiyasi JUNO43 bilan bog'lanishni deyarli butunlay bekor qiladi.Bundan tashqari, IZUMO1 va SPACA6 o'rtasidagi domen yo'nalishidagi farq SPACA6-dagi ekvivalent mintaqaning JUNO-bog'lash joyining sirt maydonini sezilarli darajada oshirdi (S14g-rasm).
Gameta sintezi uchun SPACA6 ga ma'lum ehtiyoj va uning IZUMO1 bilan o'xshashligiga qaramay, SPACA6 ekvivalent JUNO bog'lash funktsiyasiga ega emas.Shuning uchun biz o'z tarkibiy ma'lumotlarimizni evolyutsion biologiya tomonidan taqdim etilgan muhim dalillar bilan birlashtirishga harakat qildik.SPACA6 gomologlarining ketma-ketligi sutemizuvchilardan tashqari umumiy tuzilmaning saqlanishini ko'rsatadi.Masalan, sistein qoldiqlari hatto uzoq qarindosh amfibiyalarda ham mavjud (6a-rasm).ConSurf serveridan foydalanib, SPACA6 yuzasiga 66 ta ketma-ketlikning bir nechta ketma-ketlik hizalamasini saqlash ma'lumotlari ko'rsatilgan.Ushbu turdagi tahlil oqsil evolyutsiyasi jarayonida qaysi qoldiqlar saqlanib qolganligini ko'rsatishi mumkin va qaysi sirt mintaqalari funktsiyada rol o'ynashini ko'rsatishi mumkin.
a CLUSTAL OMEGA yordamida tayyorlangan 12 xil turdagi SPACA6 ektodomenlarining ketma-ketligi.ConSurf tahliliga ko'ra, eng konservativ pozitsiyalar ko'k rang bilan belgilangan.Sistein qoldiqlari qizil rang bilan ta'kidlangan.Domen chegaralari va ikkilamchi tuzilma elementlari hizalanishning yuqori qismida ko'rsatilgan, bu erda o'qlar b-iplarni, to'lqinlar esa spirallarni ko'rsatadi.Ketma-ketliklarni o'z ichiga olgan NCBI kirish identifikatorlari quyidagilardir: inson (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapuchin maymun (Cebus mimic, XP_017359366), ot (Equcin2, killball) (Equcin2) biz orca3_23 XP_032_034) .), qoʻy (Ovis aries, XP_014955560), fil (Loxodonta africana, XP_010585293), it (Canis lupus familyis, XP_025277208), sichqoncha (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian1156381, Tasmanians11, XP36 318), platypus, 8) , 61_89 va Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Raqamlash inson tartibiga asoslanadi.b SPACA6 strukturasining yuqori qismida 4HB va pastda Ig-ga o'xshash domen bilan yuzaki tasviri, ConSurf serveridan olingan saqlash hisob-kitoblariga asoslangan ranglar.Eng yaxshi saqlangan qismlar ko'k rangda, o'rtacha saqlanib qolgan qismlar oq rangda va eng kam saqlanib qolganlar sariq rangda.binafsha sistein.Yuqori darajadagi himoyani ko'rsatadigan uchta sirt yamoqlari yorliqli 1, 2 va 3 qo'shimchalarida ko'rsatilgan. Yuqori o'ngdagi ichki qismda 4HB multfilmi ko'rsatilgan (bir xil rang sxemasi).
SPACA6 strukturasi uchta yuqori darajada saqlanib qolgan sirt hududiga ega (6b-rasm).1-yamoq 4HB va ilgak hududini qamrab oladi va ikkita konservalangan CXXC disulfid ko'prigi, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 menteşe tarmog'i (S7-rasm) va uchta konservalangan tashqi aromatik qoldiqlarni (Phe31, Tyr73, Phe137) o'z ichiga oladi.sperma yuzasida bir nechta musbat zaryadlangan qoldiqlarni ifodalovchi Ig-ga o'xshash domenning kengroq rom (S6e-rasm).Qizig'i shundaki, bu patchda SPACA6 30 funktsiyasiga xalaqit berishi ko'rsatilgan antikor epitopi mavjud.3-hudud Ig-ga o'xshash domenning menteşesi va bir tomonini qamrab oladi;bu hududda saqlangan prolinlar (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) va tashqariga qaragan qutbli/zaryadlangan qoldiqlar mavjud.Ajablanarlisi shundaki, 4HB yuzasidagi qoldiqlarning aksariyati juda o'zgaruvchan (6b-rasm), garchi burma SPACA6 homologi bo'ylab (hidrofobik to'plam yadrosining konservatizmi bilan ko'rsatilgandek) va IST superfamiliyasidan tashqarida saqlanadi.
Garchi bu SPACA6 da eng kam aniqlanadigan ikkilamchi tuzilma elementlariga ega boʻlgan eng kichik hudud boʻlsa-da, koʻplab ilmoq mintaqasi qoldiqlari (shu jumladan 3-hudud) SPACA6 gomologlari orasida yuqori darajada saqlanib qolgan, bu esa spiral toʻplam va b-sendvichning yoʻnalishi muhim rol oʻynashini koʻrsatishi mumkin.konservativ sifatida.Biroq, SPACA6 va IZUMO1 ning sharnir mintaqasidagi keng vodorod bog'lanishi va elektrostatik tarmoqlarga qaramasdan, IZUMO137,43,44 ning bir nechta ruxsat etilgan tuzilmalarini moslashtirishda ichki moslashuvchanlik dalillarini ko'rish mumkin.Alohida domenlarning hizalanishi yaxshi bir-biriga mos tushdi, lekin domenlarning bir-biriga nisbatan yo'nalishi markaziy o'qdan 50 ° dan 70 ° gacha o'zgardi (S16-rasm).Eritmadagi SPACA6 ning konformatsion dinamikasini tushunish uchun SAXS tajribalari o'tkazildi (S17a,b-rasm).SPACA6 ektodomenini ab initio rekonstruksiya qilish novda kristalli strukturasiga mos keldi (S18-rasm), garchi Kratki uchastkasi ma'lum darajada moslashuvchanlikni ko'rsatdi (S17b-rasm).Bu konformatsiya IZUMO1 dan farq qiladi, bunda bog‘lanmagan oqsil ham panjara ichida, ham eritmada bumerang shaklini oladi43.
Moslashuvchan hududni maxsus aniqlash uchun SPACA6 da vodorod-deyteriy almashinuvi massa spektroskopiyasi (H-DXMS) amalga oshirildi va IZUMO143 da ilgari olingan ma'lumotlar bilan solishtirildi (7a,b-rasm).SPACA6 IZUMO1 ga qaraganda aniqroq moslashuvchan, bu 100 000 s almashinuvdan keyin butun tuzilmada yuqori deyteriy almashinuvidan dalolat beradi.Ikkala tuzilmada ham menteşe mintaqasining C-terminal qismi yuqori darajadagi almashinuvni ko'rsatadi, bu, ehtimol, bir-biriga nisbatan 4HB va Ig-ga o'xshash domenlarning cheklangan aylanishiga imkon beradi.Qizig'i shundaki, 147 CDLPLDCP154 qoldig'idan tashkil topgan SPACA6 menteşesining C-terminal qismi yuqori darajada saqlanib qolgan 3-hududdir (6b-rasm), ehtimol domenlararo moslashuvchanlik SPACA6 ning evolyutsion tarzda saqlanib qolgan xususiyati ekanligini ko'rsatadi.Moslashuvchanlik tahliliga ko'ra, CD termal eritma ma'lumotlari SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) dan kamroq barqaror ekanligini ko'rsatdi (S1e va S19-rasm).
a SPACA6 va b IZUMO1 ning H-DXMS tasvirlari.Ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida deyteriy almashinuvining foizi aniqlandi.Vodorod-deyteriy almashinuvi darajalari ko'k (10%) dan qizil (90%) gacha bo'lgan gradient shkalasida rang bilan ko'rsatilgan.Qora qutilar yuqori almashinuv sohalarini ifodalaydi.Kristal strukturada kuzatilgan 4HB, menteşe va Ig-ga o'xshash domenning chegaralari birlamchi ketma-ketlikning yuqorisida ko'rsatilgan.10 s, 1000 s va 100 000 s da deyteriy almashinuvi darajalari SPACA6 va IZUMO1 ning shaffof molekulyar yuzalariga o'rnatilgan chiziqli diagrammada chizilgan.Deyteriy almashinuvi darajasi 50% dan past bo'lgan tuzilmalarning qismlari oq rangga ega.H-DXMS almashinuvi 50% dan yuqori bo'lgan joylar gradient shkalasida ranglanadi.
CRISPR/Cas9 va sichqon genini nokaut qilish genetik strategiyalaridan foydalanish sperma va tuxumni bog'lash va sintez qilish uchun muhim bo'lgan bir qancha omillarni aniqlashga olib keldi.IZUMO1-JUNO va CD9 strukturasining yaxshi tavsiflangan o'zaro ta'siridan tashqari, gametalarning sintezi bilan bog'liq bo'lgan oqsillarning aksariyati tizimli va funktsional jihatdan sirli bo'lib qoladi.SPACA6 ning biofizik va strukturaviy tavsifi urug'lantirish paytida yopishqoqlik / termoyadroviy molekulyar jumboqning yana bir qismidir.
SPACA6 va IST super oilasining boshqa a'zolari sutemizuvchilar, shuningdek, alohida qushlar, sudraluvchilar va amfibiyalarda yuqori darajada saqlanib qolgan;Aslida, SPACA6 hatto zebrafishda urug'lantirish uchun ham zarur deb hisoblanadi 59. Bu taqsimot DCST134, DCST234, FIMP31 va SOF132 kabi gameta sintezi bilan bog'liq bo'lgan boshqa ma'lum oqsillarga o'xshaydi va bu omillar HAP2 etishmovchiligi (shuningdek) ekanligini ko'rsatadi. GCS1 sifatida tanilgan) ko'plab protistalarning katalitik faolligi uchun mas'ul bo'lgan oqsillar., o'simliklar va artropodlar.Urug'langan termoyadroviy oqsillar 60, 61. SPACA6 va IZUMO1 o'rtasidagi kuchli strukturaviy o'xshashlikka qaramasdan, bu oqsillardan birini kodlovchi genlarning nokauti erkak sichqonlarda bepushtlikka olib keldi, bu ularning gameta sintezidagi funktsiyalari takrorlanmasligini ko'rsatadi..Kengroq ma'noda, sintezning yopishish bosqichi uchun zarur bo'lgan ma'lum sperma oqsillarining hech biri ortiqcha emas.
SPACA6 (va IST superoilasining boshqa a'zolari) intergametik birikmalarda ishtirok etadimi, muhim oqsillarni termoyadroviy nuqtalarga jalb qilish uchun intragametik tarmoqlarni hosil qiladimi yoki hatto qiyin fuzogenlar sifatida ishlaydimi, bu ochiq savol bo'lib qolmoqda.HEK293T hujayralarida birgalikda immunoprecipitatsiya tadqiqotlari to'liq uzunlikdagi IZUMO1 va SPACA632 o'rtasidagi o'zaro ta'sirni aniqladi.Biroq, bizning rekombinant ektodominlarimiz in vitro o'zaro ta'sir qilmadi, bu Noda va boshqalarda ko'rilgan o'zaro ta'sirlarni ko'rsatadi.konstruksiyada ikkalasi ham oʻchirib tashlangan (IZUMO1 ning sitoplazmatik dumiga eʼtibor bering, bu urugʻlantirish uchun kerak emasligi koʻrsatilgan62).Shu bilan bir qatorda, IZUMO1 va/yoki SPACA6 biz in vitroda ko‘paytirmaydigan maxsus bog‘lanish muhitini talab qilishi mumkin, masalan, fiziologik o‘ziga xos konformatsiyalar yoki boshqa oqsillarni o‘z ichiga olgan molekulyar komplekslar (ma’lum yoki hali kashf etilmagan).IZUMO1 ektodomani spermatozoidlarning perivitellin bo'shlig'ida tuxumga biriktirilishiga vositachilik qiladi deb ishonilgan bo'lsa-da, SPACA6 ektodomenining maqsadi aniq emas.
SPACA6 tuzilishi oqsil-oqsil o'zaro ta'sirida ishtirok etishi mumkin bo'lgan bir nechta saqlanib qolgan sirtlarni ochib beradi.Menteşe mintaqasining CXXC motifiga bevosita tutashgan qismida (yuqoridagi 1-yamoq bilan belgilangan) ko'pincha biomolekulalar orasidagi hidrofobik va p-stacking o'zaro ta'siri bilan bog'liq bo'lgan bir nechta tashqi tomonga qaragan aromatik qoldiqlar mavjud.Igga o'xshash domenning keng tomonlari (2-mintaqa) yuqori darajada saqlanib qolgan Arg va Uning qoldiqlari bilan musbat zaryadlangan truba hosil qiladi va bu hududga qarshi antikorlar ilgari gamet sintezini blokirovka qilish uchun ishlatilgan 30 .Antikor chiziqli epitop 212RIRPAQLTHRGTFS225 ni taniydi, u oltita arginin qoldig'idan uchtasiga ega va yuqori darajada saqlanib qolgan His220.Disfunktsiya bu o'ziga xos qoldiqlarning yoki butun mintaqaning bloklanishiga bog'liqmi, aniq emas.Bu bo'shliqning b-sendvichning C-terminusiga yaqin joylashishi qo'shni sperma oqsillari bilan cis-o'zaro ta'sirini ko'rsatadi, lekin oosit oqsillari bilan emas.Bundan tashqari, menteşe ichida juda moslashuvchan prolinga boy chigalning (3-sayt) saqlanishi oqsil-oqsil o'zaro ta'sir joyi bo'lishi mumkin yoki, ehtimol, bu ikki domen o'rtasidagi moslashuvchanlikning saqlanishini ko'rsatadi.SPACA6 ning noma'lum roli uchun jins muhim ahamiyatga ega.gametalarning birlashishi.
SPACA6 hujayralararo adezyon oqsillari, shu jumladan Ig-ga o'xshash b-sendvichlarning xususiyatlariga ega.Ko'pgina yopishqoq oqsillar (masalan, kaderinlar, integrinlar, adezinlar va IZUMO1) oqsillarni hujayra membranasidan atrof-muhit maqsadlarigacha kengaytiradigan bir yoki bir nechta b-sendvich domenlariga ega63,64,65.SPACA6 ning Ig-ga o'xshash domeni, shuningdek, yopishqoqlik va birikishning b-sendvichlarida tez-tez uchraydigan motivni o'z ichiga oladi: mexanik qisqichlar deb nomlanuvchi b-sendvichlarning uchlarida parallel iplarning dubletlari66.Ushbu motiv hujayralararo o'zaro ta'sirlarda ishtirok etadigan oqsillar uchun qimmatli bo'lgan kesish kuchlariga qarshilikni oshiradi, deb ishoniladi.Biroq, adezinlarga o'xshashligiga qaramay, hozirda SPACA6 ning tuxum oqi bilan o'zaro ta'siri haqida hech qanday dalil yo'q.SPACA6 ektodomani JUNO bilan bog'lana olmaydi va SPACA6-ni ifodalovchi HEK293T hujayralari, bu erda ko'rsatilganidek, zona 32 bo'lmagan oositlar bilan deyarli o'zaro ta'sir qilmaydi.Agar SPACA6 intergametik aloqalarni o'rnatsa, bu o'zaro ta'sirlar translatsiyadan keyingi o'zgarishlarni yoki boshqa sperma oqsillari tomonidan barqarorlashtirishni talab qilishi mumkin.Oxirgi gipotezani qo'llab-quvvatlash uchun IZUMO1 etishmovchiligi bo'lgan spermatozoidalar oositlarga bog'lanib, IZUMO1 dan boshqa molekulalarning gameta yopishish bosqichida ishtirok etishini ko'rsatadi 27 .
Ko'pgina virusli, hujayrali va rivojlanishdagi termoyadroviy oqsillar fusogenlar sifatidagi funktsiyalarini oldindan aytib beradigan xususiyatlarga ega.Masalan, virusli termoyadroviy glikoproteinlar (I, II va III sinflar) xost membranasiga kiritilgan oqsilning oxirida hidrofobik termoyadroviy peptid yoki halqaga ega.IZUMO143 ning gidrofillik xaritasi va IST super oilasining tuzilishi (aniqlangan va bashorat qilingan) aniq hidrofobik termoyadroviy peptidni ko'rsatmadi.Shunday qilib, agar IST superoilasidagi har qanday oqsil fusogenlar vazifasini bajarsa, ular buni boshqa ma'lum misollardan farqli ravishda bajaradilar.
Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, gameta sintezi bilan bog'liq bo'lgan oqsillarning IST superfamiliyasi a'zolarining funktsiyalari hayratlanarli sir bo'lib qolmoqda.Bizning xarakterli SPACA6 rekombinant molekulasi va uning hal qilingan tuzilishi ushbu umumiy tuzilmalar o'rtasidagi munosabatlar va ularning gametalarning biriktirilishi va sintezidagi roli haqida tushuncha beradi.
Bashorat qilingan inson SPACA6 ektodomeniga mos keladigan DNK ketma-ketligi (NCBI kirish raqami NP_001303901.1; qoldiqlar 27-246) Drosophila melanogaster S2 hujayralarida ifodalash uchun kodon optimallashtirildi va gen fragmenti sifatida Kozakurofinlar ketma-ketligi bilan sintez qilindi., Puromitsin (pMT-puro) bilan tanlash uchun o'zgartirilgan metallotionin promouteriga asoslangan pMT ifoda vektoriga bu genni ligatsiyadan mustaqil klonlash uchun BiP sekretsiya signali va mos keladigan 5 'va 3' uchlari.pMT-puro vektori trombin ajralish joyini, so'ngra 10x-His C-terminal tegini kodlaydi (S2-rasm).
SPACA6 pMT-puro vektorining D. melanogaster S2 (Gibco) hujayralariga barqaror transfeksiyasi IZUMO1 va JUNO43 uchun ishlatiladigan protokolga o'xshash tarzda amalga oshirildi.S2 hujayralari eritildi va Shnayder muhitida (Gibco) o'stirildi, yakuniy konsentratsiyali 10% (v/v) issiqlik bilan inaktivlangan homila buzoq zardobi (Gibco) va 1X antimikotik antibiotik (Gibco) bilan to'ldiriladi.Erta o'tish hujayralari (3,0 x 106 hujayralar) 6-quduqli plitalarning (Korning) alohida quduqlarida qoplangan.27 ° C da 24 soat inkubatsiyadan so'ng hujayralar ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq 2 mg SPACA6 pMT-puro vektori va Effectene transfeksiya reagenti (Qiagen) aralashmasi bilan transfektsiya qilindi.Transfektsiyalangan hujayralar 72 soat davomida inkubatsiya qilingan va keyin 6 mg / ml puromisin bilan yig'ilgan.Keyin hujayralar to'liq Schneider muhitidan ajratildi va katta hajmdagi protein ishlab chiqarish uchun sarumsiz Insect-XPRESS muhitiga (Lonza) joylashtirildi.S2 hujayra madaniyatining 1 L partiyasi 2 L ventilyatsiya qilingan tekis taglikli polipropilen Erlenmeyer kolbasida 8-10 × 106 ml-1 hujayragacha o'stirildi va so'ngra 500 mkM CuSO4 (Millipore Sigma) yakuniy konsentratsiyasi bilan sterilizatsiya qilindi va steril filtrlanadi.qo'zg'atilgan.Induktsiya qilingan madaniyatlar 27 ° C da 120 rpm da to'rt kun davomida inkubatsiya qilindi.
SPACA6 ni o'z ichiga olgan shartli muhit 5660 × g da 4 ° C da santrifüjlash orqali, so'ngra 10 kDa MWCO membranasiga ega Centramate tangensial oqim filtrlash tizimi (Pall Corp) tomonidan ajratilgan.2 ml Ni-NTA agaroz qatroni (Qiagen) ustuniga SPACA6 ni o'z ichiga olgan konsentrlangan muhitni qo'llang.Ni-NTA qatroni 50 mM yakuniy imidazol kontsentratsiyasini berish uchun 10 ustun hajmli (CV) bufer A bilan yuvildi va keyin 1 CV bufer A qo'shildi.SPACA6 imidazol bilan to'ldirilgan 10 ml tampon A bilan 500 mM yakuniy konsentratsiyaga elutildi.Cheklov sinfi trombini (Millipore Sigma) to'g'ridan-to'g'ri dializ trubasiga (MWCO 12-14 kDa) 1 birlikda mg SPACA6 va dializ uchun 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 va 150 mM NaCl (bufer B) ga qo'shildi.) 4°C da 48 soat davomida.Trombin bilan parchalangan SPACA6 tuz konsentratsiyasini kamaytirish uchun uch marta suyultirildi va 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 bilan muvozanatlashtirilgan 1 ml MonoS 5/50 GL kation almashish ustuniga (Cytiva/GE) yuklandi.Kation almashtirgich 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 bilan yuvilgan, keyin SPACA6 25 OK uchun 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 da 0 dan 500 mm NaCl gacha chiziqli gradient bilan elutsiya qilingan.Ion almashinish xromatografiyasidan so'ng, SPACA6 1 ml ga konsentrlangan va B buferi bilan muvozanatlashtirilgan ENrich SEC650 10 x 300 ustunidan (BioRad) izokratik tarzda elutsiya qilingan. Xromatogrammaga ko'ra, SPACA6 ni o'z ichiga olgan hovuz va konsentrat fraktsiyalari.Soflik 16% SDS-poliakrilamid jelida Coomassie bo'yalgan elektroforez bilan nazorat qilindi.Protein kontsentratsiyasi 280 nm da Beer-Lambert qonuni va nazariy molyar yo'q bo'lib ketish koeffitsienti yordamida yutilish orqali aniqlandi.
Tozalangan SPACA6 bir kechada 10 mM natriy fosfat, pH 7,4 va 150 mM NaF ga qarshi dializ qilindi va CD spektroskopiyasi orqali tahlil qilishdan oldin 0,16 mg/ml gacha suyultirildi.To'lqin uzunligi 185 dan 260 nm gacha bo'lgan kompakt disklarni spektral skanerlash Jasco J-1500 spektropolarimetrida 1 mm optik yo'l uzunligi (Helma) bo'lgan kvarts kyuvetlari yordamida 25 ° C da 50 nm / min tezlikda to'plangan.CD spektrlari bazaviy tuzatildi, o'rtacha 10 dan ortiq qabul qilindi va sm2/dmol darajalarida o'rtacha qoldiq elliptiklikka (thMRE) aylantirildi:
bu yerda MW har bir namunaning Da da molekulyar og'irligi;N - aminokislotalar soni;th - milligraddagi elliptiklik;d optik yo'lning sm uzunligiga to'g'ri keladi;birliklarda protein konsentratsiyasi.