310 10 * 1 mm zanglamaydigan po'latdan yasalgan o'ralgan quvurlar kimyoviy komponenti, spidroinning N-terminal domenlari amiloid fibrillalari asosida gidrogellar hosil qiladi va oqsillarni immobilizatsiya qilish uchun platformani ta'minlaydi.

Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydigan brauzer versiyasidan foydalanmoqdasiz.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptlarsiz ko'rsatamiz.
Har bir slaydda uchta maqolani ko'rsatadigan slayderlar.Slaydlar boʻylab harakatlanish uchun “Orqaga” va “Keyingi” tugmalaridan yoki har bir slayd boʻylab harakatlanish uchun oxiridagi slaydni boshqarish tugmalaridan foydalaning.

Spetsifikatsiya

310 10 * 1mm zanglamaydigan po'latdan yasalgan o'ralgan quvurlar etkazib beruvchilari

Kimyoviy tarkibi

Mexanik xususiyatlar

Rekombinant o'rgimchak ipak oqsillari (o'rgimchak ipak oqsillari) yangi biomateriallarni ishlab chiqishda ko'plab potentsial qo'llanmalarga ega, ammo ularning multimodal va agregatsiyaga moyilligi ularni olish va ulardan foydalanishni osonlashtiradi.Bu erda biz rekombinant miniatyura spidroin oqsillari va, eng muhimi, N-terminal domenining (NT) o'zi 37 ° C da tezda o'zini o'zi qo'llab-quvvatlovchi va shaffof gidrogellarni hosil qilishini xabar qilamiz.NT va yashil floresan oqsil yoki purin nukleosid fosforilazdan iborat termoyadroviy oqsillar to'liq funktsional termoyadroviy oqsillarni hosil qiladi.Gidrogellar.Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, rekombinant NT va termoyadroviy oqsillar yuqori ekspressiv rentabellikni ta'minlaydi va gidrogellarga shaffoflik, o'zaro bog'lanishsiz jelleşme va yuqori zichlikdagi faol oqsillarni bevosita immobilizatsiyasi kabi jozibali xususiyatlarga ega.
O'rgimchaklarda yetti xil ipak bezlari mavjud bo'lib, ularning har biri o'ziga xos ipak ishlab chiqaradi.Ipakning yetti turining barchasi uzunligi taxminan 6000 qoldiq bo'lgan o'rgimchak ipak oqsillaridan (spidroinlar) tashkil topgan va sferik N- va C-terminal domenlari (NT va CT) bilan o'ralgan katta markaziy takrorlash hududini o'z ichiga oladi.Ipakning eng ko'p o'rganilgan turi, birlamchi ampula, birlamchi ampula bezi tomonidan ishlab chiqariladi.Bu bezda epiteliy hujayralarining bir qavati spidroin oqsillarini sintez qiladi va ularni bezning bo'shlig'iga ajratadi, bu erda ular eruvchan shaklda (doping) juda yuqori konsentratsiyalarda (30-50% t/h) mavjud3,4.Bezdagi asosiy ampulyar spidroin oqsillarining tashkil etilishi va konformatsiyasi muhokama qilingan, ammo eksperimental dalillarning aksariyati odatda spiral va / yoki tasodifiy spiral konformatsiya va miselyar yoki qatlamli tuzilmalar mavjudligini ko'rsatadi5,6,7,8,9,10.Takrorlanuvchi domenlar ipak tolalarining mexanik xususiyatlarini tartibga solib, b-varaq nanokristallari va amorf tuzilmalarni hosil qiladi11,12,13,14,15, oxirgi domenlar ipak bezi bo'ylab o'zgaruvchan sharoitlarga javoban ipak tolalarini tartibga soladi16,17,18.Ipak hosil bo'lishini nazorat qilish orqali 19. Terminal domenlari evolyutsion tarzda saqlanib qoladi va ularning funktsiyasi barcha spidroin oqsillari uchun umumiy bo'lishi mumkin 2,20,21.Bez orqali o'tish paytida spidroinning pH qiymati taxminan 7,6 dan <5,716 gacha pasayadi va asta-sekin torayib borayotgan kanal orqali harakatlanish vositasida kesish va cho'zilish bilan ortadi.Eritmada CT a-spiral konstitutsiyaviy parallel dimer17, lekin past pH va kesish kuchlariga javoban CT ochiladi va b-qatlamlarni16, 17 o'zgartiradi, ehtimol Convert 16 ning takrorlanuvchi hududlarida b-qatlamlarni tetiklaydi. NT monomerik bo'ladi. Bezning lümenindeki sharoitlarni aks ettiruvchi va spidroinning eruvchanligiga vositachilik qiladi, ammo pH pasayganda, bir qator karboksilik kislota yon zanjirlarining protonlanishi pKa taxminan 6,5 ga teng bo'lgan NT ning dimerlanishiga olib keladi va shu bilan NTni barqarorlashtiradi va katta hajmdagi spidroinni mahkamlaydi. miqdorlar.tarmoqlar16,18.Shunday qilib, NT filament shakllanishida asosiy rol o'ynaydi, qoplamadagi monomerdan toladagi dimerga o'zgaradi23,24,25.NT 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 yillargacha o'rganilgan barcha sharoitlarda yuqori darajada eriydi va spiral bo'lib qoladi, bu uning geterologik oqsillarni ishlab chiqarish uchun eruvchanlikni oshiruvchi yorliq sifatida rivojlanishiga ilhom berdi.
Bir NT, bitta qisqa takrorlash hududi, bitta KT va tozalash uchun His6 yorlig'idan (His-NT2RepCT) iborat rekombinant mini o'rgimchak ipak oqsili mahalliy o'rgimchak ipak oqsili kabi suvli buferda eriydi va ipak o'rgimchakning mahalliy muhim xususiyatlarini taqlid qiladi. .qamrovi 25.31.His-NT2RepCT biomimetik mashina yordamida uzluksiz tolalarga aylantirilishi mumkin, unda pH 8 eruvchan qoplama pH 525,32,33,34,35 suv hammomiga ekstrude qilinadi.His-NT2RepCT ni ifodalovchi E. coli ning bioreaktor fermentatsiyasi va keyingi davolash natijasida tozalashdan keyin >14 g/L hosil bo'ldi.His-NT2RepCT ning yuqori hosildorligi, yuqori eruvchanligi va kislotali sharoitlarga adekvat javob berishi NT23, 25, 34 bilan bog'liq.
Bu erda biz 37 ° C da protein eritmasini inkubatsiya qilish orqali rekombinant spidroin oqsillaridan, shu jumladan faqat NTdan shaffof gidrogellarning tez shakllanishi haqida xabar beramiz.Tioflavin T floresansi (ThT), Furye transform infraqizil spektroskopiyasi (FTIR), yadro magnit-rezonans spektroskopiyasi (NMR) va transmissiya elektron mikroskopiyasidan (TEM) foydalanib, biz NT va mikroo'rgimchak oqsillari b-varaqqa va amiloidga o'xshash fibrillarga tarkibiy o'zgarishlarga duchor bo'lishini aniqladik. jellar hosil bo'lganda.Bundan tashqari, NT va yashil floresan oqsil (GFP) yoki purin nukleosid fosforilaz (PNP) ning termoyadroviy oqsillari to'liq funktsional termoyadroviy fragmentlarga ega gidrogellarni hosil qiladi.Fiziologik sharoitda gidrogellarning tez shakllanishi bilan birga geterologik xostlarda yuqori o'tkazuvchanlik ifodasi muhandislik funktsiyalariga ega bo'lgan gidrogellarni tejamkor ishlab chiqarish imkoniyatini ochadi.
Ko'pgina ma'lum qilingan rekombinant spidroin oqsillaridan farqli o'laroq, His-NT2RepCT Tris-HCl buferida pH 8 da barqaror bo'lib, yog'ingarchiliksiz 500 mg/ml gacha konsentratsiyalanishi mumkin25.Shuning uchun, biz bu oqsil 37 ° C da inkubatsiya qilinganida optik jihatdan tiniq, o'z-o'zini qo'llab-quvvatlovchi gidrogellarni tezda hosil qilishini bilib hayron bo'ldik (1b-d-rasm).Keyingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, His-NT2RepCT gelatsiyasi protein konsentratsiyasining keng diapazonida (10-300 mg / ml) sodir bo'lgan va bu konsentratsiya jelleşme vaqti bilan teskari bog'liqdir (1c-rasm va qo'shimcha 1-rasm).His-NT2RepCT ning qaysi qismlari gidrogel hosil bo'lishiga vositachilik qilishini bilish uchun biz har bir domenni alohida va turli kombinatsiyalarda flakon inversiyasi tahlili yordamida tekshirdik (1a,b-rasm).Rekombinant spidroinning barcha sinovdan o'tgan fraktsiyalari cho'kma 2Repdan tashqari (1b-rasm) 1 soatdan kamroq vaqt ichida jellarni (300 mg / ml protein konsentratsiyasida) hosil qildi.Bu shuni ko'rsatadiki, faqat NT va KT, kombinatsiyalangan yoki takroriy takrorlash bilan bog'liq holda, 37 ° C da jelga aylanishi mumkin va His6 yorlig'i bu jarayonga sezilarli darajada ta'sir qilmaydi.NT yuqori darajada eriydigan va barqaror oqsil ekanligi va rekombinant spidroin gidrogellarining oldingi hisobotlarida takroriy hududlar va/yoki KTlardagi konformatsion o'zgarishlarga jelleşme ta'sirini berganligi haqidagi umumiy tushunchani hisobga olsak, NTning o'zi ham shunday bo'lishi mumkin.Jellanishning kashf etilishi kutilmagan edi.Qo'shimcha jadval 1) 37, 38, 39. Ajablanarlisi shundaki, NT ≥ 300 mg/ml konsentratsiyada 10 daqiqa ichida jelga aylangan (1c-rasm).NT ning turli konsentrasiyalari bilan flakon inversiyasi tajribalari shuni ko'rsatdiki, >50 mg/ml da NT eritmasi mos keladigan konsentratsiyada His-NT2RepCT dan tezroq jellanadi (g/v, 1c-rasm).
Ushbu ishda o'rganilgan turli xil spidroin konstruktsiyalarining sxematik tasviri.b Har xil rekombinant spidroin oqsillari (300 mg/ml) uchun 37 °C da jel vaqti flakonni teskari aylantirish orqali tasdiqlangan.KT jeli darhol inkubatsiyasiz (<300 mg/ml), 2Rep cho'kmalari (300 mg/ml, 5 mm shkala).c His-NT2RepCT va NT ning jel vaqti 37 ° C da ko'rsatilgan protein konsentratsiyasida.d His-NT2RepCT va NT gidrogellarining o'rgimchak va ostida "NT" harfi bosilgan fotosuratlari (ikkalasi ham 200 mg/ml, masshtab chizig'i 5 mm).
Har xil rekombinant spidroin oqsillari tomonidan hosil qilingan gidrogellar bir oz boshqacha ranglarga ega va yalang'och ko'z bilan kuzatish turli darajadagi shaffoflikni ko'rsatadi (1b-rasm).NT jellari juda shaffof, boshqa jellar esa shaffof bo'lmaydi.Silindrsimon naychalarga quyilgan His-NT2RepCT va NT jellarini qolipdan buzilmagan holda olib tashlash mumkin edi (1d-rasm).
Tabiiy o'rgimchak ipak qoplamalari hozirgi vaqtda rekombinant spidroin oqsillarining jellanishiga olib kelishi aniqlangan sharoitlarda gel yoki yo'qligini tekshirish uchun shved ko'prigi o'rgimchakning (Larinioides sclopetarius) katta ampula bezidan qoplamalar yig'ildi.Qoplamalar 20 mM Tris-HCl buferida 50 mg / ml da (o'lchangan quruq vaznga qarab) saqlangan, ammo 37 ° C da 21 kunlik inkubatsiya paytida jelleşme kuzatilmagan (Qo'shimcha rasm 2a).
Ushbu jellarning miqdorini aniqlash uchun reologik o'lchovlar jelleşme jarayonini o'rganish va umumiy mexanik xususiyatlarni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin.Xususan, yuqori haroratlarda saqlash modulini (elastiklik) kuzatish jelleşme harorati, shuningdek, qoplamaning viskoelastik xususiyatlari haqida ma'lumot berishi mumkin.Haroratning ko'tarilishi bo'yicha tajribalar (25-45 ° C da 1 ° C/min yordamida, tabiiy ipak eritmalaridan foydalangan holda oldingi tadqiqotlar asosida) 40,41 His-NT2RepCT va NT eritmalarining saqlash modullari harorat oshishi bilan ortib borishini ko'rsatdi.oshirildi (2-rasm va qo'shimcha 3-rasm).Shunisi e'tiborga loyiqki, NT moduli His-NT2RepCT bilan solishtirganda pastroq haroratda o'sishni boshladi, bu NT to'g'ridan-to'g'ri His-NT2RepCT bilan 37 ° C da inkubatsiya qilinganida kuzatilgan tezroq jel vaqtiga mos keladi (1-rasm).Haroratning keyingi pasayishidan so'ng, saqlash moduli pastroq qiymatlarga qaytmadi va yo'qotish modulidan yuqori bo'lib qoldi (Qo'shimcha 3-rasmga qarang), bu termal qaytarilmas barqaror jelatsiyani ko'rsatadi.Jellanishdan so'ng, 100-500 mg / ml konsentratsiyada His-NT2RepCT gidrogellari uchun oxirgi elastik modul 15 dan 330 kPa gacha, NT gidrogellari (100-500 mg / ml) uchun oxirgi elastik modul 2 dan 1400 gacha bo'lgan. kPa (2-rasm va to'liq rampa ma'lumotlari) Qo'shimcha 3-rasmga qarang).
a His-NT2RepCT (300 mg/mL) va b NT (300 mg/mL) ni chayqash bilan o'lchashda haroratning o'zgarishi.Oklar harorat tendentsiyasini ko'rsatadi va saqlash moduli ma'lumotlarining engilroq soyasi asbob uchun ishlab chiqaruvchi tomonidan belgilanganidan pastroq moment qiymatlarida sinovni ko'rsatadi, bu esa shovqinning kuchayishiga sabab bo'ladi.c Ko'tarilgan haroratdan (100, 300 va 500 mg/ml) so'ng His-NT2RepCT va NT ning oxirgi modulda to'planishi.Barcha modul ko'rsatkichlari 0,1 Gts chastotada olinadi.
Jellanish bilan bog'liq konformatsion o'zgarishlarni tekshirishning potentsial usuli sifatida biz His-NT2RepCT va NT ning FTIR spektrlarini 37 ° C da jelleşmeden oldin va keyin qayd etdik (3a, b-rasm).Kutilganidek, His-NT2RepCT va NT eritmalarining spektrlari a-spiral/tasodifiy spiralning ikkilamchi tuzilishini ko'rsatuvchi oqsillarga to'g'ri keldi, aniq talaffuz 1645 sm-1 da.Ikkala gidrojel uchun jelatsiya natijasida o'rta I bandida taxminan 1617 sm-1 va 1695 sm-1 da ikkita qo'l hosil bo'ldi (3a, b-rasm), bu antiparallel b-varaq tuzilmalarining shakllanishini ko'rsatadi.Ushbu o'zgarishlarni tegishli ikkinchi hosila va farqli jelatsiya spektrlarida ham aniq ko'rish mumkin (Qo'shimcha 4b-rasm).NT b-qatlamining ikkita bandi His-NT2RepCT ga qaraganda aniqroq edi, bu NT gidrogelidagi b-qatlam bantlarining umumiy miqdori NT2RepCT gidrogelidan yuqori ekanligini ko'rsatadi.
His-NT2RepCT va b NT (ikkalasi 500 mg/ml) ning FTIR yutilish spektrlari (eritma) va 37°C da inkubatsiyadan keyin (jel).c qayta suspenziya qilingan 50 mg/ml NT2RepCT jellarining TEM tasvirlari va d NT.O'lchov paneli 200 nm.e His-NT2RepCT va NT gidrogellarining tola diametri.n = 100 o'lchangan fibrillalar, p <0,0001.Xato satrlari standart og'ishni ko'rsatadi.Xato satrlarining markazi o'rtacha hisoblanadi.Statistik tahlil uchun juftlashtirilmagan t-testi (ikki dumli) ishlatilgan.f Har xil rekombinant spidroin oqsillarining ThT floresansi (100 mg/mL) 37 °C da silkitmasdan.0%, 5%, 10% va 20% urug'lar bilan 100 mg / ml NT jelidan g NT (100 mg / ml) emlash tajribalari.
Jelni transmissiya elektron mikroskopi (TEM) yordamida tahlil qilish gidrogelning amiloidga o'xshash fibrillalardan iborat ekanligini ko'rsatdi (3c, 3d-rasm).NT hosil bo'lgan fibrillalar cho'zilgan (diametri 5-12 nm) va tarvaqaylab ketgan, His-NT2RepCT fibrillalari uzunligi qisqaroq va diametri sezilarli darajada kengroq (7-16 nm) (3e-rasm).Ushbu natijalar bizga tioflavin T (ThT) tahlili yordamida fibrozning kinetikasini kuzatish imkonini berdi.Barcha rekombinant spidroin oqsillari uchun namunalar 37 °C da inkubatsiya qilinganida lyuminestsent signal ortdi (3f-rasm, qo'shimcha 5a-rasm).Ushbu topilmaga muvofiq, jelleşme sharoitida NT va His-NT2RepCT ning mikroskopik tekshiruvi ThT-musbat agregatlarning sezilarli mahalliy to'planishisiz ThT floresansining bir xil o'sishini aniqladi (Qo'shimcha rasm. 5b, c).ThT-musbat fibrillalarning shakllanishi NT va His-NTCT loyqaligining ortishi bilan birga bo'lmadi (qo'shimcha rasm 5d), bu jeldagi fibrillalar tarmog'i jel tiniqligini buzmasdan hosil bo'lishi mumkinligini anglatadi.Oldindan hosil bo'lgan fibrillalarni oz miqdorda qo'shib ekish ba'zi amiloidlarning fibril shakllanishini sezilarli darajada tezlashtirishi mumkin42,43,44, lekin NT gidrokoagulyantlar eritmasiga 5%, 10% yoki 20% (w/w) NT qo'shiladi.ekish effekti (3g-rasm).Ehtimol, bu gidrogeldagi fibrillalarning nisbatan mahkamlanganligi va urug' sifatida ishlatilishi mumkin emasligi bilan bog'liq.
Rekombinant spidroin oqsillarining yuqori haroratlarda kutilmagan xatti-harakati jel hosil bo'lishi bilan bog'liq konformatsion o'zgarishlarni aniqlash uchun yadro magnit-rezonans (NMR) spektroskopiyasining keyingi tadqiqotlariga turtki bo'ldi.Vaqt o'tishi bilan 37 ° C da qayd etilgan His-NT2RepCT eritmalarining NMR spektrlari KT hali ham qisman buklanganligini ko'rsatdi, NT va 2Rep signallari esa yo'qolgan (4a-rasm), bu asosan NT va 2Rep ekanligini ko'rsatdi. NT2RepCT gidrogel.KT signali ham asl intensivligining 20% ​​gacha zaiflashdi, bu KT ham asosan o'rnatilgan va gidrogel tuzilishiga kiritilganligini ko'rsatadi.Oldindan inkubatsiya qilingan namunadagi kabi harakatlanuvchi va shu tariqa NMR eritmasi bilan kuzatilgan KT ning kichikroq qismi uchun spektrlarda His-NT2Rep biriktirilgan qismining qiyin immobilizatsiyasi tufayli dastlabki 10 ta tuzilmali qoldiq uchun signallar yo'q.Hidrojellarning -NT2RepCT holatining NMR spektrlari a-spirallar va b-qatlamlarning ustun mavjudligini va kamroq darajada tasodifiy bobin konformatsiyasini aniqladi (4b-rasm).Faqat NTda mavjud bo'lgan metionin qoldiqlarining kimyoviy siljishi tahlili shuni ko'rsatdiki, bu domen b-varaq strukturasiga aylantirilgan.Eritmadagi NT ning vaqtga bog'liq spektrlari signal intensivligining bir xil pasayishini ko'rsatdi (4c-rasm), va NT gidrogellarining qattiq holatdagi NMR ko'rsatdiki, NT qoldiqlarining ko'p qismi b-varaq tuzilmalariga aylantirildi (4d-rasm).2Rep moslashuvini uning yig'ilish tendentsiyasi tufayli alohida aniqlash mumkin emas edi.Biroq, NTCT va His-NT2RepCT gidrogellarining qattiq holatdagi NMR spektrlari juda o'xshash edi (4b-rasm; Qo'shimcha rasm. 6b), bu 2Rep His-NT2RepCT gidrogelining tarkibiy qismiga ozgina hissa qo'shganligini ko'rsatadi.CT gidrogellari uchun a-spirallar, b-varaqlar va tasodifiy spiral ikkilamchi tuzilmalar mavjudligi aniqlandi (Qo'shimcha rasm. 6d).Bu shuni ko'rsatadiki, KTning ba'zi qismlari a-spiral bo'lib qoladi, boshqalari esa b-varaqqa aylanadi.Shunday qilib, NMR spektroskopiyasi natijalari shuni ko'rsatadiki, NT gidrogel hosil bo'lishi uchun muhim va shuningdek, 2Rep va CT bilan birlashganda b-bargli konformatsiyaga aylanadi.Shunga mos ravishda, yaqinda biz amiloid fazoviy fermuarlar NT domenining barcha beshta spirallarida paydo bo'lishi mumkinligini aniqladik va Vals algoritmi spiral 1da amiloidogen mintaqani bashorat qildi (4e-rasm).
15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT eritmasining 2D spektrlari (ko'k) va inkubatsiyadan 19 soat keyin (qizil) 37 ° C da.Qizil spektrdagi individual o'zaro faoliyat cho'qqilar va ko'k spektrdagi F24, G136, polyA bir harfli aminokislota belgilari va qoldiq raqamlari bilan belgilanadi.Qo'shimchalar NT, 2Rep va CT domenlaridan tanlangan qoldiqlar uchun signal intensivligining vaqtga bog'liqligini ko'rsatadi.b His-NT2RepCT gidrogellarining qattiq holatdagi radiochastota (RFDR) spektrlari.RFDR spektrlarida kuzatilgan Ca/Cb qoldiqlarining korrelyatsiyasi model peptid kimyoviy siljishlari va statistik ma'lumotlardan olingan qiymatlar82,83 va ularning ikkilamchi tuzilmalari bilan taqqoslash yo'li bilan aniqlandi.SSB - aylanadigan yon tasma.c 37 °C da 36 soat davomida inkubatsiya paytida 15N-HSQC 10 mg/mL NT eritmasining bir o'lchovli spektrlari.Kiritilgan vaqtga nisbatan hajmli intensivlikni ko'rsatadi.d NT gidrogellarining qattiq holatdagi RFDR spektrlari.RFDR spektrlarida kuzatilgan Ca/Cb qoldiqlari va ularning ikkilamchi tuzilmalarining korrelyatsiyasi ko'rsatilgan.e Zipper ma'lumotlar bazasidagi NT45.79 fibrilatsiyaga moyillik profili asosida (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Geksapeptidning fazoviy chaqmoq siljishi oynasining Rosetta energiyasi kkal/molda ko'rsatilgan.Qizil chiziqlar yuqori fibroz moyilligi bo'lgan geksapeptidlarni bildiradi (Rozetta energiyasi -23 kkal/moldan past; nuqta chiziq ostida).Yashil chiziqlar Rosetta energiyalari chegaradan yuqori bo'lgan qismlarni ko'rsatadi va shuning uchun sterik fermuarlar hosil qilish ehtimoli kamroq.Prolinni o'z ichiga olgan fragmentlar tahlildan chiqarildi (ustunlarsiz).Kvadratchalar Vals algoritmi81 (https://waltz.switchlab.org) tomonidan bashorat qilingan amiloidoz sohalarini bildiradi.NT ning aminokislota qoldiqlari ketma-ketligi yuqorida joylashgan va b ikkilamchi strukturada topilgan qoldiqlarning turlari (qattiq holatdagi NMR spektroskopiyasi bilan aniqlanadi) qizil rangda ko'rsatilgan.Beshta NT a-spiralining joylashuvi (H1-H5)28 sifatida belgilanadi.
PH <6,5 da HT dimerlanadi, issiqlik yoki karbamid denaturatsiyasiga chidamli bo'ladi18.NT dimerizatsiyasi va barqarorligi jelatsiyaga qanday ta'sir qilishini tushuntirish uchun 100 mg / ml NT o'z ichiga olgan eritmalar flakon inversiyasi testi yordamida pH 8, 7 va 6 da nazorat qilindi.PH 8 va 7 da inkubatsiya qilingan NT namunalari 37 °C da 30 daqiqadan so'ng jelga aylandi, ammo pH 8 jeli shaffof bo'lib qoldi, pH 7 jeli esa ko'rinadigan cho'kmani ko'rsatdi (5a-rasm).Aksincha, pH 6 da HT o'z ichiga olgan eritma jel hosil qilmadi va 37 ° C da 20 daqiqadan so'ng katta cho'kma paydo bo'ldi.Bu shuni ko'rsatadiki, dimerlarning o'zlari va / yoki ularning monomerlarga nisbatan yuqori barqarorligi jelleşmeyi oldini oladi.pH 7 va 6 da NT uchun cho'kma hosil bo'lishi kutilmadi, chunki NT 200 mg/ml27 da eriydi, issiqlik denaturatsiyasidan keyin osongina qayta katlanadi, shuningdek, pastroq qiymatlarda a-spiralni saqlaydi. pH 18. Ushbu nomuvofiqliklarning taxminiy izohi shundan iboratki, avval xabar qilingan tajribalar xona haroratida yoki undan pastda yoki nisbatan past protein konsentrasiyalarida o'tkazilgan16,18,19.
37°C da inkubatsiyadan keyin pH 8, 7, 6 va 154 mM NaCl (pH 8) da NT flakonini inversiya testi (100 mg/mL).b NT CD spektrlari mos ravishda 154 mM NaF va 154 mM NaCl bilan va ularsiz.222 nm da molar elliptiklik tabiiy burmalarning ulushiga aylanadi.c NT inversiya tahlili (100 mg/mL) NT* (37 °C va 60 °C), NTA72R (37 °C) va His-NT-L6 (37 °C va 60 °C).d NT mutantlari NT*, NTA72R va His-NT-L6 CD spektrlari.222 nm da molar elliptiklik tabiiy burmalarning ulushiga aylanadi.e NTFlSp, NTMiSp va kamaytirilgan NTMiSp (100 mg/ml) ning inversiya testi.O'lchov paneli 5 mm.f NT, NTFlSp, NTMiSp va qisqartirilgan NTMiSp ning CD spektrlari.222 nm da molar elliptiklik tabiiy burmalarning ulushiga aylanadi.25 °C va 95 °C da to'liq NT spektrlari qo'shimcha 8-rasmda ko'rsatilgan.
Fiziologik tuz konsentratsiyasi NT subbirliklari o'rtasidagi elektrostatik o'zaro ta'sirlarni va NT ning past pH18 ga o'tishining dimerizatsiyasini aniqlaydi.Biz 154 mM NaCl va NaF ning mavjudligi mos ravishda gellanishni inhibe qilganligini aniqladik (5a-rasm; b; Qo'shimcha 2b-rasm) va bu tuzlar NT monomerlarining termal barqarorligini oshirdi (5b-rasm, qo'shimcha 8-rasm). .Bundan tashqari, dimerizatsiya emas, balki barqarorlikni oshirish jel shakllanishini oldini oladi.
Protein dimerizatsiyasi va jelatsiyadagi barqarorlikning rolini yanada o'rganish uchun biz ikkita mutant, NT * va NTA72R dan foydalandik, ular ham past pH28.30 da monomer bo'lib qoladi.NT* ikki zaryadli teskari mutant bo'lib, unda monomerning ko'rinadigan dipolyar zaryad taqsimoti tekislanadi, bu dimerizatsiyani oldini oladi va monomer barqarorligini keskin oshiradi.NTA72R zaryadlangan dipoldir, lekin Arg bilan almashtirilgan Ala dimer chegarasida joylashgan, shuning uchun mutatsiyalar dimerizatsiya uchun zarur bo'lgan subbirliklarning o'zaro ta'siriga xalaqit beradi.37°C da inkubatsiyadan so‘ng NT* gidrogel hosil qilmadi, NTA72R esa 15 daqiqa davomida shaffof bo‘lmagan jel hosil qildi (5c-rasm).NT* va NTA72R ikkalasi ham dimerlasha olmaydi, lekin monomer barqarorligida farq qiladi (5d-rasm), bu natijalar yuqori termodinamik barqarorlik NT ning jelleşmesini oldini olishini aniq ko'rsatadi.Bu, shuningdek, HT* yuqori haroratda beqaror bo'lganida (60 ° C da 8 daqiqadan so'ng; 5c-rasm) jel hosil qilishi bilan tasdiqlanadi.Ilgari NT tarkibidagi metioninning yuqori miqdori uning tabiiy katlamini suyultirishi va oltita Met to Leu o'rnini bosuvchi moddalar (bu erda His-NT-L6 deb ataladi) NT46 monomerini kuchli barqarorlashtirishi ilgari ko'rsatilgan.NT jelining shakllanishi uchun strukturaviy moslashuvchanlik zarur degan taxminga asoslanib, biz His-NT-L6 barqaror mutantining 37 °C da jelga aylanmaganligini aniqladik (5c, d-rasm).Biroq, His-NT-L6 60°S da 60 minut inkubatsiyada ham gel hosil qildi (5c-rasm).
NT ning b-varaqli tuzilmalarga aylanishi va gidrogellar hosil qilish qobiliyati spidroinning barcha NT domenlariga emas, balki ba'zilariga tegishli ko'rinadi.Turli xil ipak turlari va o'rgimchak turlaridan NTlar, Trichonephila clavipes (NTFlSp), metionin miqdori nisbatan past va yuqori termal barqarorlikka qaramay, jellar hosil qildi (5e, f-rasm va 2-jadval).Bundan farqli o'laroq, Araneus ventricosus (NTMiSp) dan olingan kichik ampulyar protein spidroinidan past termal barqarorlik va yuqori metionin tarkibiga ega bo'lgan NT gidrogellarni hosil qilmadi (2-jadval va 5e, f-rasm).Ikkinchisi molekulyar disulfid aloqalari mavjudligi bilan bog'liq bo'lishi mumkin29,47.Izchil ravishda, NTMiSp ning disulfid aloqalari kamaytirilganda, u 37 ° C da 10 daqiqa davomida inkubatsiyadan so'ng gidrogel hosil qildi (5e-rasm).Xulosa qilib shuni ta'kidlash kerakki, strukturaviy moslashuvchanlik NT dan jel hosil qilish uchun muhim, ammo yagona mezon emas.Tegishli bo'lishi mumkin bo'lgan yana bir omil - bu amiloid fibrillalarini shakllantirishga moyillik va fermuar ma'lumotlar bazasi va Vals algoritmi yordamida tahlil jellar hosil qilish qobiliyati va amiloidogen hududlarning mavjudligi, shuningdek, prognoz qilingan hududlarning ko'lami o'rtasidagi bog'liqlikni ko'rsatdi. sterik fermuarlar hosil qilish uchun.Korrelyatsiya mavjud edi (2-jadval va qo'shimcha 9-rasm).
NT ning qulay sharoitlarda fibrillalar hosil qilish va jellarni hosil qilish qobiliyati bizni NTning boshqa oqsil bo'laklari bilan birlashishi hali ham termoyadroviy sheriklarning to'liq funktsiyasiga ega jellarni hosil qilishi mumkin degan farazga olib keldi.Buni sinab ko'rish uchun biz NT ning C-terminusida navbati bilan yashil floresan protein (GFP) va purin nukleosid fosforilazni (PNP) kiritdik.Olingan termoyadroviy oqsillar E. coli da juda yuqori yakuniy hosil bilan ifodalangan (His-NT-GFP va His-NT-PNP uchun mos ravishda 150 mg/L va 256 mg/L chayqaladigan kolba kulturalari), ko'rsatilganlarga mos keladi. NT bilan birlashtirilgan boshqa oqsillar uchun Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) va His-NT-PNP (100mg/mL) termoyadroviy oqsillari 37°C da 2 soat va 6,5 ​​soatdan keyin jel hosil qildi va eng muhimi, GFP fraktsiyasi o'zgarishsiz qoldi.jellanishdan so'ng kuzatiladi, jellanishdan keyin boshlang'ich floresan intensivligining >70% qoladi (6a-rasm).His-NT-PNP eritmalari va jellarida PNP faolligini o'lchash uchun biz termoyadroviy oqsilni NT bilan suyultirishimiz kerak edi, chunki sof preparatning fermentativ faolligi jelleşme kontsentratsiyasida tahlilning aniqlash oralig'idan tashqarida edi.0,01 mg/ml His-NT-PNP va 100 mg/mL NT o'z ichiga olgan aralashma bilan hosil bo'lgan jel oldindan inkubatsiya qilingan namunalarning dastlabki fermentativ faolligining 65% ni saqlab qoldi (6b-rasm).O'lchov davomida jel buzilmagan holda qoldi (qo'shimcha 10-rasm).
His-NT-GFP (300 mg/ml) va His-NT-GFP gidrogel (300 mg/mL) bo'lgan teskari flakonning ko'rinadigan va UV nurlari ostida jelleşmesidan oldin va keyin nisbiy floresans intensivligi.Ballar individual o'lchovlarni ko'rsatadi (n = 3), xato chiziqlari standart og'ishni ko'rsatadi.O'rtacha qiymat xato satrlari markazida ko'rsatilgan.b PNP faolligi NT (100 mg / ml) va 0,01 mg / ml his-NT-PNP va 100 mg / ml Yangi Tayvan dollarini o'z ichiga olgan aralashmadan tashkil topgan eritmalar va jellar yordamida florometrik tahlil orqali olingan.Ichkarida His-NT-PNP (5 mm shkalasi) bo'lgan gidrogel bo'lgan teskari flakon ko'rsatilgan.
Bu erda biz NT va boshqa rekombinant spidroin oqsillaridan gidrogellarning hosil bo'lishi haqida 37 ° C da protein eritmasini inkubatsiya qilish orqali xabar beramiz (1-rasm).Jellanish a-spirallarning b-qatlamlarga aylanishi va amiloidga o'xshash fibrillalar hosil bo'lishi bilan bog'liqligini ko'rsatamiz (3 va 4-rasm).Bu topilma hayratlanarli, chunki NTlar bir necha kun davomida 4°C da >200 mg/ml konsentrasiyalarda juda yuqori eruvchanligi va yuqori barqarorligi bilan mashhur boʻlgan oʻralgan globulyar besh spiralli toʻplamlardir27.Bundan tashqari, NTlar µM dagi past protein konsentratsiyasida issiqlik denaturatsiyasidan so'ng osongina qayta tiklanadi.Bizning natijalarimizga ko'ra, fibril shakllanishi >10 mg/ml protein konsentratsiyasi va biroz ko'tarilgan haroratning kombinatsiyasini talab qiladi (1-rasm).Bu fiziologik sharoitda termal tebranishlar tufayli qisman ochilgan holatda bo'lgan globulyar qatlamli oqsillardan amiloid fibrillalari hosil bo'lishi mumkin degan fikrga mos keladi 48.Ushbu konversiyadan o'tadigan oqsillarga misollar: insulin49,50, b2-mikroglobulin, transtiretin va lizozim51,52,53.NT o'zining tabiiy holatida a-spiral bo'lsa-da, polipeptid zanjirining taxminan 65% sterik fermuar shakllanishiga mos keladi (4e-rasm) 45 .Monomer dinamik ravishda harakatchan bo'lgani uchun46, bu potentsial amiloidogen hududlarni o'rtacha ko'tarilgan haroratda va umumiy oqsilning yuqori konsentratsiyasida amiloid fibril shakllanishi uchun kritik konsentratsiyaga erishishi mumkin54.Ushbu mulohazalardan so'ng, biz spidroin kontsentratsiyasi va jelleşme vaqti o'rtasida salbiy bog'liqlikni topdik (1c-rasm) va agar monomerik NT konformatsiyasi mutatsiyalar (NT *, His-NT-L6) yoki tuz qo'shilishi bilan barqarorlashsa, buning oldini olishi mumkin. hosil bo'ladigan gidrogellar (5-rasm).
Aksariyat hollarda amiloid fibrillalar eritmadan cho'kma holida yo'qoladi, ammo ma'lum sharoitlarda ular gidrogellar hosil qilishi mumkin55,56,57.Gidrojel hosil qiluvchi fibrillalar odatda yuqori nisbatga ega va molekulyar bog'lanish orqali barqaror uch o'lchovli tarmoqlarni hosil qiladi,55,58 bizning natijalarimizga mos keladi.In vitro gidrogel shakllanishi uchun oqsillar ko'pincha to'liq yoki qisman ochiladi, masalan, organik erituvchilar, yuqori harorat (70-90 ° C) va / yoki past pH (1,5-3,0) 59,60,61,62.Bu erda tasvirlangan spidroin gidrogellari qattiq ishlov berishni talab qilmaydi va gidrogellarni barqarorlashtirish uchun o'zaro bog'lovchi vositalarni talab qilmaydi.
Ilgari ma'lum bo'lishicha, ipak yigirish jarayonida b-varaqqa almashinadigan ko'rinadigan spidroin takrorlari va QDlar gidrogellarni hosil qiladi.Bizning topilmalarimiz bilan solishtirganda, inkubatsiya vaqtlari va/yoki inkubatsiya harorati mos ravishda sezilarli darajada uzoqroq yoki yuqoriroq bo'lgan va hosil bo'lgan gidrogellar ko'pincha shaffof bo'lmagan (7-rasm va qo'shimcha jadval 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Tez jel vaqtlariga qo'shimcha ravishda, NT gidrogellari >300 mg/ml (30%) barcha tavsiflangan rekombinant o'rgimchak ipak oqsili gidrogellaridan, shuningdek, jelatin, alginat (2%), agar (0,5%) kabi tabiiy gidrogellardan ustun keldi. ) va kollagen.(0,6%) (7-rasm va qo'shimcha 1 va 3-jadvallar)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Ushbu tadqiqotda gidrogellarning jel vaqti va elastik moduli boshqa spidroin asosidagi gidrogellar va tanlangan tabiiy gidrogellar bilan taqqoslandi.Ma'lumotnomalar jelleşme shartlari tavsifi bilan birga berilgan.APS Ammoniy persulfat, xona harorati.37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 maʼlumotlari.
O'rgimchaklar saqlash vaqtida spidroinning jelleşmesini oldini olish usullarini ishlab chiqqan ko'rinadi.Ipak bezida oqsilning yuqori kontsentratsiyasiga qaramasdan, terminal sohasi bilan bog'liq bo'lgan katta takroriy hudud bu tadqiqot chegarasida bezdagi NT va KTning ko'rinadigan kontsentratsiyasi taxminan 10-20 mg / ml ga to'g'ri kelishini anglatadi.in vitro kuzatilgan gidrogel shakllanishi uchun zarur.Bundan tashqari, tuzlarning 16 shunga o'xshash konsentratsiyasi ipak bezlarida bo'lgani kabi NTni barqarorlashtirdi (5b-rasm).NT konformatsiyasi E. coli sitozolida o'rganilgan va in vitro tekshirilgandan ko'ra qattiqroq buklanganligi aniqlangan, bu esa tuz yoki boshqa omillar uning in vivo agregatsiyasiga to'sqinlik qilishini ko'rsatadi.Biroq, NTlarning b-varaq fibrillalariga aylanish qobiliyati filament shakllanishi uchun muhim bo'lishi mumkin va kelajakdagi tadqiqotlarda tekshirilishi kerak.
Ushbu tadqiqotda kuzatilgan NT-amiloidga o'xshash fibril va gidrogel shakllanishining yangi jihatlariga qo'shimcha ravishda, biz ushbu hodisaning biotexnologik va biotibbiyotda qo'llanilishi mumkinligini ham ko'rsatamiz (8-rasm).Kontseptsiyaning isboti sifatida biz NTni GFP yoki PNP bilan birlashtirdik va termoyadroviy oqsil 37 °C da inkubatsiya qilinganida gidrogellar hosil qilishini va GFP va PNP fraktsiyalari jelleşmedan keyin o'z faolligini asosan saqlab qolishini ko'rsatdik (6-rasm).Nukleozid fosforilazalari nukleozid analoglari sintezining muhim katalizatorlari75 bo'lib, bu bizning kashfiyotimizni biofarmatsevtika sanoati uchun dolzarb qiladi.Qulay sharoitlarda shaffof gidrogellarni hosil qiluvchi termoyadroviy oqsillarni ifodalash kontseptsiyasi fermentlarni immobilizatsiya qilish, boshqariladigan dori-darmonlarni chiqarish va to'qimalarni muhandislik kabi keng doiradagi ilovalar uchun qulay xususiyatlarga ega funktsional gidrogellarni yaratishga imkon beradi.Bundan tashqari, NT va NT* samarali ifoda belgilaridir30, ya'ni NT va uning variantlari eruvchan termoyadroviy oqsillarni yuqori o'tkazuvchanlik bilan ishlab chiqarish va keyinchalik 3D gidrogellarda immobilizatsiyalangan maqsadli oqsillarni yaratish uchun ishlatilishi mumkin.
NT eruvchan, a-spiralsimon va past konsentratsiyalarda (µM) va 37°C da barqaror.Xuddi shu haroratda, lekin ortib borayotgan konsentratsiyada (>10 mg / ml) NT amiloidga o'xshash fibrillalardan tashkil topgan jellarni hosil qiladi.NT termoyadroviy oqsillari, shuningdek, to'liq ishlaydigan termoyadroviy fragmentlarga ega bo'lgan fibrilyar jellarni hosil qiladi, bu esa turli oqsillarni NT yordamida 3D gidrogellarda immobilizatsiya qilish imkonini beradi.Pastki: NT (PDB: 4FBS) va tolali tarmoqlar va tegishli oqsil tuzilmalarining rasmlari (taxmin qilingan va miqyosda chizilmagan, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4R).
Konstruktsiyalar (aminokislotalar ketma-ketligini o'z ichiga olgan to'liq ro'yxat uchun Qo'shimcha 4-jadvalga qarang) pT7 plazmidiga klonlandi va E. coli BL21 (DE3) ga aylantirildi.Muhandislik plazmidlarini o'z ichiga olgan E. coli kanamitsin (70 mg / l) bilan to'ldirilgan Luria bulonida emlangan va bir kechada 30 ° C va 250 rpm da o'stirilgan.Keyin kultura kanamitsinni o'z ichiga olgan LB muhitiga 1/100 ga ekilgan va OD600 0,8 ga yetguncha 30 ° C va 110 aylanish tezligida ekilgan.NMR tadqiqotlari uchun bakteriyalar 2 g D-glyukoza 13C (Aldrich) va 1 g ammoniy xlorid 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) ni o'z ichiga olgan M9 minimal muhitida izotoplar bilan oqsillarni belgilash uchun o'stirildi.Haroratni 20 daraja Selsiyga tushiring va 0,15 mM izopropiltiogalaktopiranozid (yakuniy konsentratsiya) bilan oqsil ifodasini qo'zg'ating.Bir kechada protein ifodalanganidan so'ng, hujayralar 20 daqiqa davomida 7278 × g, 4 ° C da yig'ib olindi.Hujayra pelletlari 20 mM Tris-HCl, pH 8 da qayta suspenziya qilindi va keyingi foydalanishgacha muzlatildi.Eritilgan hujayralar hujayra buzilishi (TS seriyali mashinalar, Constant Systems Limited, Angliya) yordamida 30 kPa da lizing qilindi.Keyin lizatlar 4°C da 30 daqiqa davomida 25000 g da santrifüj qilindi.NTMiSp uchun pellet 2 M karbamid, 20 mM Tris-HCl, pH 8 ichida qayta suspenziya qilindi va 2 daqiqa davomida sonikatsiya qilindi (2 s yoqish / o'chirish, 65%), keyin yana 25 000 xg, 4 ° C da santrifüj qilindi. 30 min.Supernatant Ni-NTA ustuniga yuklangan, 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8 bilan yuvilgan va nihoyat oqsil 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazol, pH 8 bilan elutsiya qilingan. NT2Rep hosil qilish uchun NTCT, trombin hazm qilish His va NT o'rtasidagi saytni (ThrCleav) kiritadi.Trombin ajralish joylari His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep hosil qiladi), His-tioredoksin-ThrCleav-NT (NT hosil qiladi), His-tioredoksin-ThrCleav-CT (KT ishlab chiqaradi), His-Tioredoxin-ThrCleav-NTda ham mavjud. .* (NT* ishlab chiqaradi), His-Tioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R ishlab chiqaradi), His-Tioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp ishlab chiqaradi) va His-oltingugurtli redoksin-ThrCleav-NTMiSp (NTMSp hosil qiladi).Konstruksiyalar trombin (1:1000) bilan hazm qilindi va 6-8 kDa molekulyar og'irlik chegarasi bilan Spectra/Por dializ membranasi yordamida 20 mM Tris-HCl, pH 8 bilan 4 ° C da kechada dializ qilindi.Dializdan so'ng, eritma Ni-NTA kolonnasiga yuklanadi va qiziqish oqsilini o'z ichiga olgan oqava suv yig'iladi.Protein kontsentratsiyasi ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq Bredford tahlilidan foydalangan NTF1Sp bundan mustasno, har bir oqsilning so'nish koeffitsientidan foydalangan holda 280 nm da UV absorbsiyasini o'lchash yo'li bilan aniqlandi.Tozalik SDS poliakrilamid (4-20%) jel elektroforezi va Coomassie yorqin ko'k rang bilan aniqlandi.Proteinlar santrifüj filtrlari (VivaSpin 20, GE Healthcare) yordamida 4000 xg da 20 daqiqalik tsikllarda 10 kDa molekulyar og'irlik chegarasi bilan konsentratsiyalangan.
Protein eritmasini eritib oling va 1 ml shaffof septum flakoniga (8 x 40 mm Thermo Scientific) 150 mklni ehtiyotkorlik bilan pipetlang.Naychalar bug'lanishning oldini olish uchun qopqoq bilan yopilgan va parafilm bilan yopilgan.Namunalar (n = 3) 37 ° C yoki 60 ° C da inkubatsiya qilindi va jelleşmeni kuzatish uchun vaqti-vaqti bilan teskari aylantirildi.Jel bo'lmagan namunalar kamida bir hafta davomida inkubatsiya qilingan.10 mM protein uchun 10 mM DTT bilan NTMiSp disulfid aloqalarini kamaytiring.Tabiiy o'rgimchak ipak qoplamalarining jelatsiyasini tahlil qilish uchun shved ko'prigi o'rgimchak kesildi, ikkita asosiy ampulatsiyalangan bezlar 200 mkl 20 mM Tris-HCl bufer pH 8 ga joylashtirildi va qoplama bezlardan ajralib turishi uchun kesildi..Bezlarning tarkibi buferda eritiladi, quruq og'irlikni aniqlash uchun 50 µl (ochiq flakonlarni 60 ° C da doimiy og'irlikda inkubatsiya qilish orqali) va 37 ° C da jelleşme uchun 150 µl.
O'lchov geometriyasi / asbobi yuqori diametri 20 mm va bo'shliq 0,5 mm bo'lgan parallel plastinka yordamida zanglamaydigan po'latdan yasalgan.Zanglamaydigan po'latdan yasalgan pastki Peltier plitasi yordamida namunani 25 °C dan 45 °C gacha va 25 °C ga daqiqada 1 °C tezlikda qizdiring.Vibratsiyali o'lchovlar 0,1 Hz chastotada va materialning chiziqli viskoelastik hududida 100 mg / ml va 300-500 mg / ml namunalar uchun mos ravishda 5% va 0,5% kuchlanishda amalga oshirildi.Bug'lanishni oldini olish uchun maxsus namlik kamerasidan foydalaning.Ma'lumotlar Prism 9 yordamida tahlil qilindi.
800 dan 3900 sm-1 gacha bo'lgan xona haroratida infraqizil (IR) spektrlarini yig'ish uchun.ATR qurilmasi, shuningdek, spektrometr orqali yorug'lik yo'li tajribadan oldin va davomida quruq filtrlangan havo bilan tozalanadi.Eritmalar (500 mg / ml spektrlardagi suvning yutilish cho'qqilarini minimallashtirish uchun) kristallarga pipetka bilan yuborildi va o'lchashdan oldin jellar (500 mg / ml) hosil bo'ldi va keyin kristallarga o'tkazildi (n = 3).1000 ta skanerlash 2 sm-1 ruxsati bilan va 2 nol ish aylanishi bilan qayd etildi. Ikkinchi lotin OPUS (Bruker) yordamida to'qqiz nuqta tekislash diapazoni yordamida hisoblangan.Spektrlar F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" yordamida 1720 va 1580 sm-1 oralig'ida bir xil integratsiya mintaqasiga normallashtirildi.ATR-IR spektroskopiyasida infraqizil nurning namunaga kirish chuqurligi to'lqin soniga bog'liq bo'lib, yuqori to'lqin raqamlariga qaraganda pastroq to'lqin raqamlarida kuchliroq yutilishga olib keladi.Ushbu effektlar shaklda ko'rsatilgan spektrlar uchun tuzatilmagan.3 chunki ular juda kichik (Qo'shimcha 4-rasm).Ushbu raqam uchun tuzatilgan spektrlar Bruker OPUS dasturi yordamida hisoblab chiqilgan.
Asosan, amid I cho'qqisida tarkibiy qismlarning ishonchli dekonvolyutsiyasidan so'ng oqsil konformatsiyasining har tomonlama miqdoriy aniqlash mumkin.Biroq, amalda ba'zi to'siqlar paydo bo'ladi.Spektrdagi shovqin dekonvolyutsiya paytida (noto'g'ri) cho'qqilar ko'rinishida paydo bo'lishi mumkin.Bundan tashqari, suvning egilishi tufayli cho'qqi amid I cho'qqisining pozitsiyasiga to'g'ri keladi va bu erda o'rganilgan suvli jel kabi katta miqdordagi suvni o'z ichiga olgan namunalar uchun xuddi shunday kattalikka ega bo'lishi mumkin.Shuning uchun biz amid I cho'qqisini butunlay parchalashga urinmadik va bizning kuzatishlarimiz faqat NMR spektroskopiyasi kabi boshqa usullarni qo'llab-quvvatlash uchun ko'rib chiqilishi kerak.
50 mg/ml NT va His-NT2RepCT eritmalari bir kechada 37°C da jellangan.Keyin gidrogel 20 mM Tris-HCl (pH 8) bilan 12,5 mg / ml konsentratsiyaga suyultirildi, yaxshilab chayqatildi va jelni sindirish uchun pipetka bilan tortildi.Keyinchalik, gidrogel 20 mM Tris-HCl (pH 8) bilan 10 marta suyultirildi, 5 mkl namunasi formvar bilan qoplangan mis panjaraga qo'llandi va ortiqcha namuna qog'oz bilan olib tashlandi.Namunalar ikki marta 5 µl MilliQ suv bilan yuvilib, 5 daqiqa davomida 1% uranil format bilan bo‘yalgan.Ortiqcha dog'ni changni yutish qog'oz bilan olib tashlang, so'ngra to'rni havo bilan quriting.Ushbu tarmoqlarda tasvirlash 100 kV da ishlaydigan FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN yordamida amalga oshirildi.Rasmlar Veleta 2k × 2k CCD kamera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Myunster, Germaniya) yordamida x 26 500 va x 43 000 kattalashtirishda yozib olingan.Har bir namuna uchun (n = 1) 10-15 ta rasm yozib olingan.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) tasvirni tahlil qilish va tolalar diametrlarini o'lchash uchun ishlatilgan (n = 100, turli tolalar).Prizma 9 juftlashtirilmagan t-testlarini (ikki dumli) bajarish uchun ishlatilgan.O'rtacha His-NT2RepCT va NT fibrillalari mos ravishda 11,43 (SD 2,035) va 7,67 (SD 1,389) nm edi.Ishonch oralig'i (95%) -4,246 dan -3,275 gacha.erkinlik darajalari = 198, p <0,0001.
10 mkM tioflavin T (ThT) o'z ichiga olgan 80 µl suyuqlik namunalari statik sharoitda Corning 96 quduqli qora pastki shaffof pastki plitalar (Corning Glass 3881, AQSh) yordamida uch nusxada (n = 3) o'lchandi.Floresans farqlari 440 nm qo'zg'atuvchi filtr va 480 nm emissiya filtri (BMG Labtech, Offenburg, Germaniyadan FLUOStar Galaxy) yordamida qayd etilgan.ThT signali toʻyingan ham, soʻnmagan ham edi, chunki ThT ning turli konsentratsiyasi bilan tajribalar signal intensivligini oʻzgartirmasdan oʻtkazildi.Tumanni o'lchash uchun 360 nm da absorbansni yozib oling.Ekish tajribalari uchun 37 ° C da 100 mg / ml jellar hosil bo'ldi, qayta suspenziya qilindi va 5%, 10% va 20% molyar nisbatlarda ekish uchun ishlatilgan.Ma'lumotlar Prism 9 yordamida tahlil qilindi.
His-NT2RepCT va NT >100 mg/ml ni muz ustida eritib oling va 0,22 mkm filtr orqali filtrlang.Konsentratsiyalar Nanodrop yordamida 280 nm da absorbansni o'lchash yo'li bilan hisoblangan.Aniq tubi bo'lgan 96 quduqli qora bog'lanmagan plastinka (Corning) quduqlarida namunalar 20 mM Tris-HCl pH 8 da 20 mg / ml gacha suyultirildi va 5 mM ThT (yakuniy konsentratsiya), umumiy namuna konsentratsiyasi bilan aralashtirildi. 50 ml hajm.Namunalar har 10 daqiqada 37 °C da CellObserver (Zeiss) mikroskopida uzatilgan yorug'lik kanali va ThT tasvirlash uchun FITC qo'zg'atuvchi va emissiya filtri to'plamlari bilan tasvirlangan.Tasvirga olish uchun 20x/0,4 linza ishlatiladi.Rasmni tahlil qilish uchun Zen Blue (Zeiss) va ImageJ (https://imagej.nih.gov/) dan foydalanilgan.Jellar, shuningdek, NT va His-NT2RepCT eritmalaridan 20 mM Tris pH 8 va 5 mkM ThT o'z ichiga olgan 50 mg/ml konsentratsiyada tayyorlangan va 37°C da 90 daqiqa davomida inkubatsiya qilingan.Jel bo'laklari 20 mM Tris, pH 8 va 5 mkM ThT o'z ichiga olgan yangi quduqqa, bog'lanmagan qora 96 ​​quduqli shaffof pastki plastinkaga o'tkazildi.20x/0,4 kattalashtirishda yashil floresans va yorqin maydon tasvirlarini oling.ImageJ tasvirni tahlil qilish uchun ishlatilgan.
Eritmaning NMR spektrlari QCI Quadrupole Rezonans impulsli Gradient Field Cryoprobe (HFCN) bilan jihozlangan 600 MGts Bruker Avance Neo spektrometrida 310 K da olingan.20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) da erigan, 13C, 15N bilan etiketlangan 10 mg/ml bir hil proteinni o'z ichiga olgan NMR namunalari .NT2RepCT ning pH 6,7 da kimyoviy siljishi 15N-HSQC ning 2D spektrida 23 pikni belgilash uchun ishlatilgan.
3,2 mm 13C/15N{1H} elektronsiz zond bilan jihozlangan 800 MGts chastotada Bruker Avance III HD spektrometrida 13C, 15N etiketli gidrogellarning sehrli burchakli aylanuvchi qattiq NMR (MAS) spektrlari qayd etildi.Namuna harorati 277 K da o'zgaruvchan haroratli gaz oqimi yordamida nazorat qilindi. Ikki o'lchovli dipol aylanish rezonansi (DARR)76 va radiochastotani qayta ulash (RFDR)77 spektrlari mos ravishda 12,5 kHz va 20 kHz MAS chastotalarida olindi.1H dan 13C gacha bo'lgan o'zaro polarizatsiya (CP) 1H da 60,0 dan 48,0 kHz gacha, 13C da 61,3 / 71,6 kHz (12,5 / 20 kHz MAS) va aloqa vaqti 0,5-1 ms dan foydalangan holda amalga oshirildi.Ma'lumot yig'ish jarayonida 73,5 kHz chastotada Spinal6478 dekuplling ishlatilgan.Qabul qilish vaqti 10 millisekund, tsiklning kechikishi esa 2,5 soniya edi.RFDR spektrlarida kuzatilgan yagona bog'langan Ca/Cb korrelyatsiyalari DARR spektrlaridagi xarakterli qoldiq tipidagi kimyoviy siljishlar va ko'paytmali korrelyatsiyalar asosida tayinlangan.
Zipper79 ma'lumotlar bazasi (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp va NTMiSp uchun chayqalish tendentsiyalari va Rosetta energiyasini baholash uchun ishlatilgan.Zipper ma'lumotlar bazasi protein tuzilishini modellashtirish va tahlil qilish uchun bir nechta bepul energiya funktsiyalarini birlashtirgan Rosetta Energy80-ni hisoblaydi.Energiya darajasi -23 kkal/mol yoki undan past bo'lsa, fibrilatsiyaga yuqori moyillik borligini ko'rsatadi.Pastroq energiya fermuar konformatsiyasida ikkita b-torning ko'proq barqarorligini bildiradi.Bundan tashqari, Vals algoritmi NT, NTFlSp va NTMiSp Refdagi amiloidogen hududlarni bashorat qilish uchun ishlatilgan.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT oqsili eritmasi pH ni mos ravishda pH 6 va 7 ga tushirish uchun pH 5,5 va 6,0 da 2-(N-morfolino) etansulfonik kislota (MES) buferi bilan aralashtirildi.Yakuniy protein konsentratsiyasi 100 mg / ml ni tashkil etdi.
O'lchovlar J-1500 CD spektrometrida (JASCO, AQSh) optik yo'li 0,1 sm bo'lgan 300 mkL kyuvetta yordamida amalga oshirildi.Proteinlar 20 mM fosfat tamponida (pH 8) 10 mM (n = 1) ga suyultirildi.Tuz borligida oqsil barqarorligini tahlil qilish uchun oqsillar mos ravishda 154 mM NaF yoki NaCl o'z ichiga olgan 20 mM fosfat tamponida (pH 8) bir xil konsentratsiyada (n = 1) tahlil qilindi.Haroratni skanerlash 222 nm da 25 ° C dan 95 ° C gacha, 1 ° C / min isitish tezligi bilan qayd etilgan.Tabiiy katlanmış oqsillarning nisbati (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal) formulasi yordamida hisoblab chiqilgan.Bundan tashqari, har bir namuna uchun 260 nm dan 190 nm gacha 25 ° C da va 95 ° C gacha qizdirilgandan keyin beshta spektr qayd etilgan.Beshta spektr o'rtacha hisoblangan, tekislangan va molyar elliptiklikka aylantirilgan.Ma'lumotlar Prism 9 yordamida tahlil qilindi.
His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) floresans intensivligi statik sharoitda qora shaffof tubi (Corning Glass 3881, AQSh) bo‘lgan 96 quduqli Corning plitalarida uch nusxada (n = 3) o‘lchandi.Namunalarni qo'zg'atuvchi to'lqin uzunligi 395 nm bo'lgan floresan asosidagi plastinka o'quvchi bilan o'lchang va emissiyani jelleşmeden oldin 509 nm da va 2 soatdan keyin 37 ° C da yozib oling.Ma'lumotlar Prism 9 yordamida tahlil qilindi.
Purin nukleosid fosforilaza faolligini tahlil qilish to'plami (fluorometrik usul, Sigma Aldrich) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq ishlatilgan.His-NT-PNP o'z ichiga olgan jellar va eritmalardagi faollikni o'lchash uchun 10 ng His-NT-PNP ni 100 mg/ml NT bilan umumiy hajmi 2 mL gacha aralashtiring, chunki jel to'plamning aniqlash oralig'idan yuqoriroq signal berdi.His-NT-PNPsiz jellar va eritmalar uchun boshqaruv elementlari kiritilgan.O'lchovlar ikki marta amalga oshirildi (n = 2).Faoliyat o'lchangandan so'ng, reaktsiya aralashmasi olib tashlandi va o'lchov davomida jel buzilmaganligini ta'minlash uchun jel suratga olindi.Ma'lumotlar Prism 9 yordamida tahlil qilindi.
O'quv dizayni haqida ko'proq ma'lumot olish uchun ushbu maqolaga havola qilingan Tabiatni o'rganish rezyumatiga qarang.
1 va 2-rasmlarda dastlabki ma'lumotlar keltirilgan.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f va 6, Qoʻshimcha shakllar.3, qo'shimcha rasm.5a, d, qo'shimcha rasm.6 va qo'shimcha rasm.8. Ushbu tadqiqot ma'lumotlari Zenodo ma'lumotlar bazasida joylashgan https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Ushbu tadqiqotda olingan NMR ma'lumotlari BMRBig omboriga bmrbig36 kirish identifikatori ostida joylashtirildi.GFP va PNP tuzilmalari PDB dan olingan (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. va Johansson, J. Spinning sun'iy o'rgimchak ipak.Milliy kimyo.biologiya.11, 309–315 (2015).
Babb, PL va boshqalar.Nephila clavipes genomi o'rgimchak ipak genlarining xilma-xilligini va ularning murakkab ifodasini ta'kidlaydi.Milliy Genette.49, 895–903 (2017).