304 zanglamaydigan po'latdan payvandlangan o'ralgan quvur / trubkali zomponent, global dengiz mikrobiomasining biosintetik salohiyati

Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydigan brauzer versiyasidan foydalanmoqdasiz.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptlarsiz ko'rsatamiz.
Har bir slaydda uchta maqolani ko'rsatadigan slayderlar.Slaydlar boʻylab harakatlanish uchun “Orqaga” va “Keyingi” tugmalaridan yoki har bir slayd boʻylab harakatlanish uchun oxiridagi slaydni boshqarish tugmalaridan foydalaning.

Mahsulotning batafsil tavsifi

304 zanglamaydigan po'latdan payvandlangan o'ralgan quvur / quvur
1. Spetsifikatsiya: zanglamas po'latdan yasalgan lasan trubkasi / quvurlari
2. Turi: payvandlangan yoki choksiz
3. Standart: ASTM A269, ASTM A249
4. Zanglamas po'latdan yasalgan lasan trubkasi OD: 6 mm dan 25,4 mm gacha
5. Uzunlik: 600-3500MM yoki mijozning talabiga binoan.
6. Devor qalinligi: 0,2 mm dan 2,0 mm gacha.

7. Tolerantlik: OD: +/-0,01 mm;Qalinligi: +/-0,01%.

8. Bobinning ichki teshik o'lchami: 500MM-1500MM (mijoz talablariga muvofiq sozlanishi mumkin)

9. Bobin balandligi: 200MM-400MM (mijoz talablariga muvofiq sozlanishi mumkin)

10. Yuzaki: Yorqin yoki tavlangan
11. Materiallar: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, qotishma 625, 825, 2205, 2507 va boshqalar.
12. Qadoqlash: yog'och quti, yog'och pallet, yog'och mil yoki mijozning talabiga binoan to'qilgan sumkalar
13. Sinov: kimyoviy komponent, oqish quvvati, tortishish kuchi, qattiqlikni o'lchash
14. Kafolat: Uchinchi tomon (masalan: SGS TV) tekshiruvi va boshqalar.
15. Ilova: Dekoratsiya, mebel, yog 'tashuvi, issiqlik almashtirgich, panjara ishlab chiqarish, qog'oz ishlab chiqarish, avtomobil, oziq-ovqat mahsulotlarini qayta ishlash, tibbiyot va boshqalar.

Tabiiy mikrob jamoalari filogenetik va metabolik jihatdan xilma-xildir.Bu xilma-xillik yetarlicha oʻrganilmagan organizmlar guruhlaridan tashqari1, shuningdek, ekologik va biotexnologik ahamiyatga ega boʻlgan fermentlar va biokimyoviy birikmalarni kashf qilish uchun boy salohiyatga ega.Biroq, bunday birikmalarni sintez qiladigan va ularni tegishli xostlar bilan bog'laydigan genomik yo'llarni aniqlash uchun ushbu xilma-xillikni o'rganish qiyin bo'lib qolmoqda.Ochiq okeandagi mikroorganizmlarning biosintetik salohiyati global miqyosda butun genom rezolyutsiyasi ma'lumotlarini tahlil qilishdagi cheklovlar tufayli asosan noma'lum bo'lib qolmoqda.Bu yerda biz 10 000 dan ortiq dengiz suvi namunalaridan 25 000 dan ortiq yangi rekonstruksiya qilingan qoralama genomlari bilan madaniy hujayralar va yagona hujayralardan olingan 10 000 ga yaqin mikrobial genomlarni birlashtirib, okeandagi biosintetik gen klasterlarining xilma-xilligi va xilma-xilligini o'rganamiz.Ushbu sa'y-harakatlar 40 000 ga yaqin taxminiy asosan yangi biosintetik gen klasterlarini aniqladi, ularning ba'zilari ilgari shubhalanmagan filogenetik guruhlarda topilgan.Ushbu populyatsiyalarda biz o'stirilmagan bakterial filumga tegishli bo'lgan va ushbu muhitda biosintetik jihatdan eng xilma-xil mikroorganizmlarni o'z ichiga olgan biosintetik gen klasterlari ("Candidatus Eudormicrobiaceae") bilan boyitilgan naslni aniqladik.Ulardan biz fosfataza-peptid va pitonamid yo'llarini tavsifladik, mos ravishda g'ayrioddiy bioaktiv birikma tuzilishi va enzimologiyasi misollarini aniqladik.Xulosa qilib aytganda, ushbu tadqiqot mikrobiomaga asoslangan strategiyalar yaxshi tushunilmagan mikrobiota va muhitda ilgari ta'riflanmagan fermentlar va tabiiy oziq-ovqatlarni o'rganishga qanday imkon berishi mumkinligini ko'rsatadi.
Mikroblar global biogeokimyoviy tsikllarni boshqaradi, oziq-ovqat tarmoqlarini saqlaydi va o'simliklar va hayvonlarni sog'lom saqlaydi5.Ularning ulkan filogenetik, metabolik va funksional xilma-xilligi yangi taksonlar1, fermentlar va biokimyoviy birikmalarni, shu jumladan tabiiy mahsulotlarni6 kashf qilish uchun boy imkoniyatlarni ifodalaydi.Ekologik jamoalarda bu molekulalar mikroorganizmlarni turli xil fiziologik va ekologik funktsiyalar bilan ta'minlaydi, aloqadan raqobatga qadar 2, 7.Asl funktsiyalariga qo'shimcha ravishda, bu tabiiy mahsulotlar va ularning genetik kodlangan ishlab chiqarish yo'llari biotexnologik va terapevtik ilovalar uchun misollar beradi2,3.Bunday yo‘llar va bog‘lanishlarni aniqlashga yetishtirilgan mikroblarni o‘rganish katta yordam berdi.Biroq, tabiiy muhitning taksonomik tadqiqotlari shuni ko'rsatdiki, mikroorganizmlarning katta qismi etishtirilmagan8.Ushbu madaniy tarafkashlik ko'plab mikroblar tomonidan kodlangan funktsional xilma-xillikdan foydalanish qobiliyatimizni cheklaydi4,9.
Ushbu cheklovlarni bartaraf etish uchun so'nggi o'n yillikdagi texnologik yutuqlar tadqiqotchilarga to'g'ridan-to'g'ri (ya'ni, oldingi madaniyatsiz) butun jamoalardan (metagenomika) yoki bitta hujayradan mikrobial DNK parchalarini ketma-ketlashtirishga imkon berdi.Ushbu fragmentlarni kattaroq genom bo'laklariga yig'ish va mos ravishda bir nechta metagenomik tarzda yig'ilgan genomlarni (MAG) yoki bitta kuchaytirilgan genomlarni (SAG) rekonstruksiya qilish qobiliyati mikrobiomani (ya'ni, mikrob jamoalari va mikrobioma) taksosentrik tadqiqotlar uchun muhim imkoniyatni ochadi.yangi yo'llarni ochish.ma'lum muhitda o'z genetik materiali) 10,11,12.Darhaqiqat, yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar Yerdagi mikroblar xilma-xilligining filogenetik ko'rinishini sezilarli darajada kengaytirdi1, 13 va ilgari ekilgan mikroorganizmlarga tegishli genom ketma-ketliklari (REFs) bilan qamrab olinmagan individual mikrobial jamoalardagi funktsional xilma-xillikning ko'p qismini aniqladi.Ochilmagan funktsional xilma-xillikni mezbon genom kontekstida joylashtirish qobiliyati (ya'ni, genom rezolyutsiyasi) yangi tabiiy mahsulotlarni kodlashi mumkin bo'lgan hali belgilanmagan mikrobial liniyalarni bashorat qilish uchun juda muhimdir15,16 yoki bunday birikmalarni asl ishlab chiqaruvchiga qaytarish uchun17.Misol uchun, metagenomik va bir hujayrali genomik tahlilning kombinatsiyalangan yondashuvi metabolik jihatdan boy shimgich bilan bog'langan bakteriyalar guruhi Candidatus Entotheonella ni turli dori potentsiallarini ishlab chiqaruvchilar sifatida aniqlashga olib keldi18.Biroq, so'nggi paytlarda turli mikrobial jamoalarni genomik tadqiq qilish bo'yicha urinishlarga qaramay,16,19 Yerdagi eng katta ekotizimlar okeani16,20 uchun global metagenomik ma'lumotlarning uchdan ikki qismidan ko'prog'i haligacha etishmayapti.Shunday qilib, umuman olganda, dengiz mikrobiomasining biosintetik salohiyati va uning yangi fermentativ va tabiiy mahsulotlar ombori sifatidagi potentsiali ko'p o'rganilmagan.
Dengiz mikrobiomalarining biosintetik salohiyatini global miqyosda o'rganish uchun biz birinchi navbatda filogenetik va gen funktsiyasining keng ma'lumotlar bazasini yaratish uchun madaniyatga bog'liq va madaniyatga bog'liq bo'lmagan usullardan foydalangan holda olingan dengiz mikrobial genomlarini birlashtirdik.Ushbu ma'lumotlar bazasini o'rganish natijasida ko'plab biosintetik gen klasterlari (BGC) aniqlandi, ularning aksariyati hali belgilanmagan gen klasterlari (GCF) oilalariga tegishli.Bundan tashqari, biz noma'lum bakterial oilani aniqladik, u hozirgi kunga qadar ochiq okeandagi BGClarning eng yuqori ma'lum xilma-xilligini namoyish etadi.Hozirda ma'lum bo'lgan yo'llardan genetik farqlari asosida eksperimental tekshirish uchun ikkita ribosoma sintezi va post-translyatsiya qilingan peptid (RiPP) yo'llarini tanladik.Ushbu yo'llarning funktsional tavsifi enzimologiyaning kutilmagan misollarini, shuningdek, proteazni inhibe qiluvchi faollikka ega bo'lgan strukturaviy noodatiy birikmalarni aniqladi.
Dastlab biz genom tahlili uchun uning bakterial va arxeal komponentlariga e'tibor qaratgan holda global ma'lumotlar resursini yaratishni maqsad qilgan edik.Shu maqsadda biz metagenomik ma'lumotlar va 1038 ta dengiz suvi namunalarini butun dunyo bo'ylab tarqalgan 215 ta namuna olish joylaridan (kenglik diapazoni = 141,6 °) va bir nechta chuqur qatlamlardan (chuqurligi 1 dan 5600 m gacha, pelagik, mezopelagik va tubsizlik zonalarini qamrab olgan) birlashtirdik.Fon21,22,23 (1a-rasm, kengaytirilgan maʼlumotlar, 1a-rasm va qoʻshimcha 1-jadval).Keng geografik qamrovni ta'minlashdan tashqari, ushbu tanlab filtrlangan namunalar bizga dengiz mikrobiomasining turli komponentlarini, jumladan virusga boy (<0,2 mkm), prokaryotiklarga boy (0,2-3 mkm), zarrachalarga boy (0,8 mkm) solishtirish imkonini berdi. ).-20 mkm) va virus bilan yo'qolgan (>0,2 mkm) koloniyalar.
a, Dunyo bo'ylab tarqalgan 215 ta joydan (62 ° S dan 79 ° N gacha va 179 ° V dan 179 ° E gacha) to'plangan dengiz mikrobial jamoalarining umumiy foydalanish mumkin bo'lgan 1038 ta genomlari (metagenomikasi).Xarita plitkalari © Esri.Manbalar: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ va Esri.b, bu metagenomlar ma'lumotlar to'plamlarida (rang bilan belgilangan) miqdori va sifati (usullari) jihatidan farq qiluvchi MAGlarni (usullar va qo'shimcha ma'lumotlar) qayta qurish uchun ishlatilgan.Qayta tiklangan MAGlar ommaviy (tashqi) genomlar, shu jumladan qo'lda ishlangan MAG26, SAG27 va REF bilan to'ldirildi.27 OMD kompilyatsiya qilish.c, faqat SAG (GORG) 20 yoki MAG (GEM) 16 ga asoslangan oldingi hisobotlar bilan solishtirganda, OMD dengiz mikrobial jamoalarining genomik tavsifini (metagenomik o'qish xaritalash tezligi; usul) chuqurroq va izchil ifodalash bilan ikki-uch baravar yaxshilaydi. kenglik..<0,2, n=151, 0,2-0,8, n=67, 0,2-3, n=180, 0,8-20, n=30, >0,2, n=610, <30°, n = 132, 30-60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMDni turlar klasterlariga guruhlash darajasi (95% oʻrtacha nukleotid identifikatsiyasi) jami aniqlaydi taxminan 8300 tur, ularning yarmidan ko'pi ilgari GTDB (89-versiya) dan foydalangan holda taksonomik izohlarga ko'ra tavsiflanmagan e, turlarning genom turi bo'yicha tasnifi MAG, SAG va REFlarning filogenetik xilma-xilligini aks ettirishda bir-birini yaxshi to'ldirishini ko'rsatdi. dengiz mikrobiomasi.Xususan, turlarning 55%, 26% va 11% mos ravishda MAG, SAG va REF uchun xos edi.BATS, Bermuda Atlantika vaqt seriyasi;GEM, Yer mikrobiomasining genomlari;GORG, global okean mos yozuvlar genomi;HOT, Gavayi okeani vaqt seriyasi.
Ushbu ma'lumotlar to'plamidan foydalanib, biz jami 26,293 MAGni qayta tikladik, asosan bakterial va archaeal (1b-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 1b-rasm).Biz ushbu MAGlarni turli joylardan yoki vaqt nuqtalaridan (usullardan) olingan namunalar orasidagi tabiiy ketma-ketlik o'zgarishining buzilishini oldini olish uchun birlashtirilgan metagenomik namunalardan emas, balki alohida yig'ilishlardan yaratdik.Bundan tashqari, biz genomik fragmentlarni ko'p sonli namunalar bo'ylab tarqalganlik korrelyatsiyasi asosida guruhladik (so'rovga qarab 58 dan 610 tagacha namunalar; usul).Biz shuni aniqladikki, bu ko'p vaqt talab qiladigan, ammo muhim qadam24, u bir nechta keng ko'lamli MAG16, 19, 25 rekonstruksiya ishlarida o'tkazib yuborilgan va ularning miqdori (o'rtacha 2,7 marta) va sifatini (o'rtacha + 20%) sezilarli darajada yaxshilaydi. genom.bu erda o'rganilgan dengiz metagenomidan rekonstruksiya qilingan (kengaytirilgan ma'lumotlar, 2a-rasm va qo'shimcha ma'lumotlar).Umuman olganda, bu harakatlar bugungi kunda mavjud bo'lgan eng keng qamrovli MAG resursiga nisbatan 4,5 baravar (faqat yuqori sifatli MAGlar hisobga olinsa, 6 barobar) dengiz mikrobial MAG ning ko'payishiga olib keldi16 (Usullar).Ushbu yangi yaratilgan MAG to'plami keyinchalik 830 ta qo'lda tanlangan MAG26, 5969 SAG27 va 1707 REF bilan birlashtirildi.Yigirma yetti turdagi dengiz bakteriyalari va arxeya 34 799 genomdan iborat kombinatsion to'plamni tashkil etdi (1b-rasm).
Keyin biz yangi yaratilgan resursni dengiz mikrobial jamoalarini ifodalash qobiliyatini yaxshilash va turli genom turlarini integratsiyalash ta'sirini baholash uchun baholadik.O'rtacha, biz dengiz metagenomik ma'lumotlarining taxminan 40-60% ni qamrab olishini aniqladik (1c-rasm), bu faqat MAG-ga tegishli oldingi hisobotlarni chuqurlikda va kenglikda qoplaganidan ikki-uch baravar ko'proq 16 yoki SAG20.Bundan tashqari, o'rnatilgan kollektsiyalarda taksonomik xilma-xillikni tizimli ravishda o'lchash uchun biz Genom Taksonomiyasi Ma'lumotlar bazasi (GTDB) asboblar to'plami (usullari) yordamida barcha genomlarga izoh berdik va o'rtacha 95% genom bo'yicha nukleotid identifikatoridan foydalandik.28 8304 turdagi klasterlarni (turlarni) aniqlash.Ushbu turlarning uchdan ikki qismi (shu jumladan, yangi sinflar) ilgari GTDBda paydo bo'lmagan, ulardan 2790 tasi ushbu tadqiqotda qayta tiklangan MAG yordamida topilgan (1d-rasm).Bundan tashqari, biz har xil turdagi genomlar juda bir-birini to'ldiruvchi ekanligini aniqladik: 55%, 26% va 11% turlar butunlay MAG, SAG va REF dan iborat (1e-rasm).Bundan tashqari, MAG suv ustunida topilgan barcha 49 turni qamrab oldi, SAG va REF esa mos ravishda ulardan faqat 18 va 11 tasini ifodalaydi.Biroq, SAG deyarli 1300 turni va MAG atigi 390 turni qamrab olgan Pelagic Bacteriales (SAR11) kabi eng keng tarqalgan sinflarning xilma-xilligini (kengaytirilgan ma'lumotlar, 3a-rasm) yaxshiroq ifodalaydi.Shunisi e'tiborga loyiqki, REFlar tur darajasida MAG yoki SAG bilan kamdan-kam uchraydi va bu erda o'rganilgan ochiq okean metagenomik to'plamlarida topilmagan taxminan 1000 genomning >95% ni tashkil qiladi, bu asosan boshqa turdagi izolyatsiya qilingan dengiz namunalari (masalan, cho'kindilar) bilan o'zaro ta'siri tufayli. .yoki xost-assosiant).Ilmiy hamjamiyat uchun keng foydalanish uchun ushbu dengiz genom resursi, shuningdek, tasniflanmagan bo'laklarni (masalan, prognoz qilingan faglar, genomik orollar va MAG rekonstruktsiyasi uchun ma'lumotlar etarli bo'lmagan genom fragmentlari) o'z ichiga oladi, taksonomik ma'lumotlar bilan taqqoslanishi mumkin. .Okean mikrobiologiyasi maʼlumotlar bazasida (OMD; https://microbiomics.io/ocean/) gen funktsiyasi va kontekst parametrlari bilan birga izohlarga kirish.
Keyin biz ochiq okean mikrobiomalarida biosintetik potentsialning boyligi va yangiligini o'rganishga kirishdik.Shu maqsadda biz jami 39 055 BGCni bashorat qilish uchun 1038 ta dengiz metagenomlarida (usullarida) topilgan barcha MAG, SAG va REF uchun antiSMASH dan foydalandik.Keyin biz ularni 6907 ortiqcha bo'lmagan GCF va 151 gen klasteri populyatsiyalariga (GCC; Qo'shimcha 2-jadval va usullar) ajralmas ortiqchalikni (ya'ni, bir xil BGC bir nechta genomlarda kodlanishi mumkin) va metagenomik ma'lumotlarni konsentrlangan BGClarning parchalanishini hisobga olish uchun guruhladik.To'liq bo'lmagan BGClar, agar mavjud bo'lsa (Qo'shimcha ma'lumot), 44% va 86% hollarda kamida bitta buzilmagan BGC a'zosini o'z ichiga olgan GCF va GCC soni sezilarli darajada oshmadi.
GCC darajasida biz turli xil bashorat qilingan RiPPs va boshqa tabiiy mahsulotlarni topdik (2a-rasm).Ular orasida, masalan, arilpolienlar, karotenoidlar, ektoinlar va sideroforlar keng filogenetik tarqalish va okean metagenomlarida ko'p bo'lgan GCClarga tegishli bo'lib, bu mikroorganizmlarning dengiz muhitiga keng moslashuvini, shu jumladan reaktiv kislorod turlariga chidamliligini ko'rsatishi mumkin. oksidlovchi va osmotik stress..yoki temirning so'rilishi (qo'shimcha ma'lumot).Ushbu funktsional xilma-xillik NCBI RefSeq ma'lumotlar bazasida (BiG-FAM/RefSeq, bundan keyin RefSeq deb yuritiladi)29 saqlangan taxminan 190 000 genomlar orasidan taxminan 1,2 million BGCning yaqinda o'tkazilgan tahlilidan farq qiladi, bu esa ribosomal bo'lmagan Sintetaza peptidlari (NR poliketazalari) va poliketazalarni ko'rsatdi. (PKS) BGCs (Qo'shimcha ma'lumot).Biz, shuningdek, har qanday RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4; 2a-rasm va usullar) bilan uzoqdan bogʻliq boʻlgan 44 (29%) GCC va faqat MAGda 53 (35%) GCC topdik, bu esa potentsialni taʼkidladi. OMDda ilgari tavsiflanmagan kimyoviy moddalarni aniqlash uchun.Ushbu GCClarning har biri juda xilma-xil biosintetik funktsiyalarni ifodalashi mumkinligini hisobga olib, biz shunga o'xshash tabiiy mahsulotlar uchun kodlash uchun bashorat qilingan BGClarning batafsilroq guruhlanishini ta'minlash maqsadida GCF darajasida ma'lumotlarni tahlil qildik29.Jami 3861 (56%) aniqlangan GCFlar RefSeq bilan mos kelmadi va GCFlarning >97% eksperimental tasdiqlangan BGClarning eng katta maʼlumotlar bazalaridan biri boʻlgan MIBiGda mavjud emas edi (2b-rasm).Yo'naltiruvchi genom bilan yaxshi ko'rsatilmagan sharoitlarda ko'plab yangi potentsial yo'llarni kashf qilish ajablanarli bo'lmasa-da, taqqoslashdan oldin BGC-larni GCF-larga o'tkazish usuli avvalgi hisobotlardan farq qiladi 16 va bizga yangilikni xolis baholash imkonini beradi.Yangi xilma-xillikning aksariyati (3012 GCF yoki 78%) bashorat qilingan terpenlar, RiPP yoki boshqa tabiiy mahsulotlarga to'g'ri keladi va aksariyati (1815 GCF yoki 47%) biosintetik salohiyati tufayli noma'lum turlarda kodlangan.PKS va NRPS klasterlaridan farqli o'laroq, bu ixcham BGClar metagenomik yig'ilish 31 paytida parchalanish ehtimoli kamroq va ularning mahsulotlarining ko'proq vaqt va resurslarni talab qiladigan funktsional tavsifiga imkon beradi.
Jami 39 055 BGC 6 907 GCF va 151 GCCga guruhlangan.a, ma'lumotlarni taqdim etish (ichki tashqi).GCC asosida BGC masofalarini ierarxik klasterlash, ulardan 53 tasi faqat MAG tomonidan belgilanadi.GCC turli taksonlardan (ln-transformatsiyalangan eshik chastotasi) va turli BGC sinflaridan (doira hajmi uning chastotasiga mos keladi) BGC'larni o'z ichiga oladi.Har bir GCC uchun tashqi qatlam BGC sonini, tarqalishini (namunalar ulushi) va masofani (minimal BGC kosinus masofasini (min(dMIBiG))) BiG-FAM dan BGC gacha) ifodalaydi.Eksperimental tasdiqlangan BGC (MIBiG) bilan chambarchas bog'liq bo'lgan BGC'li GCC'lar strelkalar bilan ta'kidlangan.b GCFni bashorat qilingan (BiG-FAM) va eksperimental tasdiqlangan (MIBiG) BGClar bilan solishtirganda, 3861 ta yangi (d–>0,2) GCF topildi.Ushbu kodlarning aksariyati (78%) RiPP, terpenlar va boshqa taxminiy tabiiy mahsulotlar uchun.c, 1038 dengiz metagenomlarida topilgan OMDdagi barcha genomlar OMD ning filogenetik qamrovini ko'rsatish uchun GTDB asosiy daraxtiga joylashtirilgan.OMDda genomlari bo'lmagan qoplamalar kulrang rangda ko'rsatilgan.BGC soni ma'lum bir guruhdagi genom uchun taxmin qilingan BGClarning eng ko'p soniga to'g'ri keladi.Aniqlik uchun tugunlarning oxirgi 15% yiqilib ketgan.O'qlar BGC (>15 BGC) ga boy bo'lgan guruhlarni ko'rsatadi, Mycobacterium, Gordonia (faqat Rhodococcus uchun ikkinchi) va Crocosphaera (faqat Synechococcus uchun ikkinchi) bundan mustasno.d, noma'lum c.Eremiobacterota eng yuqori biosintetik xilma-xillikni ko'rsatdi (tabiiy mahsulot turiga asoslangan Shennon indeksi).Har bir tasma turdagi eng ko'p BGCga ega genomni ifodalaydi.T1PKS, PKS turi I, T2/3PKS, PKS II va III tip.
Boylik va yangilikdan tashqari, biz dengiz mikrobiomasining biosintetik salohiyatining biogeografik tuzilishini o'rganamiz.Namunalarni o'rtacha metagenomik GCF nusxalari soni taqsimoti (usullari) bo'yicha guruhlash ko'rsatdiki, past kenglik, sirt, prokaryotiklarga boy va virusga kambag'al jamoalar, asosan, er usti yoki chuqur quyoshli suvlardan, RiPP va BGC terpenlariga boy.Aksincha, qutbli, chuqur dengiz, virus va zarrachalarga boy jamoalar NRPS va PKS BGC ning yuqori ko'pligi bilan bog'liq edi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 4-rasm va qo'shimcha ma'lumotlar).Va nihoyat, biz yaxshi o'rganilgan tropik va pelagik jamoalar yangi terpenlarning eng istiqbolli manbalari ekanligini aniqladik (Kengaytirilgan ma'lumotlar rasm).PKS, RiPP va boshqa tabiiy mahsulotlar uchun eng yuqori potentsial (kengaytirilgan ma'lumotlar bilan 5a-rasm).
Dengiz mikrobiomalarining biosintetik potentsialini o'rganishni to'ldirish uchun biz ularning filogenetik taqsimotini xaritalash va BGC bilan boyitilgan yangi qatlamlarni aniqlashni maqsad qildik.Shu maqsadda biz dengiz mikroblarining genomlarini normallashtirilgan GTDB13 bakterial va arxeal filogenetik daraxtga joylashtirdik va ular kodlagan taxminiy biosintetik yo'llarni qopladik (2c-rasm).Biz siyanobakteriyalar (Synechococcus) va Proteus bakteriyalari, masalan Tistrella32,33 kabi biosintetik salohiyati bilan ma'lum bo'lgan dengiz suvi namunalarida (usullarida) bir nechta BGC bilan boyitilgan qatlamlarni (15 dan ortiq BGC bilan ifodalangan) osongina aniqladik yoki yaqinda ularning e'tiborini jalb qildik. tabiiy mahsulotlar.Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus va Planctomycetota34,35,36 kabi.Qizig'i shundaki, biz bu to'dalarda ilgari o'rganilmagan bir qancha nasllarni topdik.Masalan, Planctomycetota va Myxococcota filasidagi eng boy biosintetik potentsialga ega bo'lgan turlar mos ravishda belgilanmagan nomzodlar qatorlari va avlodlariga tegishli edi (3-jadval).Birgalikda bu shuni ko'rsatadiki, OMD ilgari noma'lum bo'lgan filogenetik ma'lumotlarga, shu jumladan mikroorganizmlarga kirishni ta'minlaydi, ular ferment va tabiiy mahsulotlarni kashf qilish uchun yangi maqsadlarni ko'rsatishi mumkin.
Keyinchalik, biz BGC bilan boyitilgan kladni nafaqat uning a'zolari tomonidan kodlangan BGC-larning maksimal sonini hisoblash, balki ushbu BGC-larning xilma-xilligini baholash orqali ham tavsifladik, bu esa har xil turdagi tabiiy nomzod mahsulotlarning chastotasini tushuntiradi (2c-rasm va usullar). )..Ushbu tadqiqotda biosintetik jihatdan eng xilma-xil turlar maxsus ishlab chiqilgan bakterial MAGlar bilan ifodalanganligini aniqladik.Bu bakteriyalar o'stirilmagan Candidatus Eremiobacterota filumiga tegishli bo'lib, ular bir nechta genomik tadqiqotlardan tashqari deyarli o'rganilmagan37,38.Shunisi e'tiborga loyiqki, "taxminan.Eremiobacterota jinsi faqat quruqlik muhitida tahlil qilingan39 va BGC bilan boyitilgan a'zolarni o'z ichiga olmaydi.Bu erda biz bir xil turdagi sakkizta MAGni qayta tikladik (nukleotidlarning o'ziga xosligi > 99%) 23. Shuning uchun biz yunon mifologiyasi va ekspeditsiyalarida go'zal sovg'a bo'lgan nereid (dengiz nimfasi) nomi bilan atalgan "Candidatus Eudoremicrobium malaspinii" turini taklif qilamiz.'Ka.13-filogenetik izohga ko'ra, E. malaspinii ning ketma-ketlik darajasidan pastroq qarindoshlari yo'q va shuning uchun biz taklif qilgan yangi bakterial oilaga tegishli "Ca.E. malaspinii” turi turlari sifatida va “Ca.Eudormicrobiaceae" rasmiy nomi sifatida (Qo'shimcha ma'lumot).'Ca ning qisqacha metagenomik rekonstruktsiyasi.E. malaspinii genom loyihasi juda kam kirish, uzoq o'qilgan metagenomik ketma-ketlik va 75 kb duplikatsiyaga ega yagona 9,63 Mb chiziqli xromosoma sifatida bitta namunani (Usullar) maqsadli yig'ish bilan tasdiqlangan.qolgan yagona noaniqlik sifatida.
Ushbu turning filogenetik kontekstini aniqlash uchun biz maqsadli genomni rekonstruksiya qilish orqali Tara okeani ekspeditsiyasidan eukaryotiklar bilan boyitilgan qo'shimcha metagenomik namunalarda 40 ta yaqin turni qidirdik.Qisqacha aytganda, biz metagenomik o'qishlarni "Ca.E. malaspinii” va bu namunadagi ishga qabul qilish darajasining ortishi boshqa qarindoshlar (usullar) mavjudligini ko'rsatadi, deb faraz qildi.Natijada, biz 10 ta MAGni topdik, ya'ni 19 MAGning kombinatsiyasi yangi aniqlangan oilada (ya'ni, "Ca. Eudormicrobiaceae") uchta avloddagi besh turni ifodalaydi.Qo'lda tekshirish va sifat nazoratidan so'ng (kengaytirilgan ma'lumotlar, 6-rasm va qo'shimcha ma'lumotlar), biz "Ca.Eudormicrobiaceae turlari boshqa "Ca" a'zolariga qaraganda kattaroq genomlarga (8 Mb) va boy biosintetik salohiyatga (har bir tur uchun 14 dan 22 BGC) ega.Clade Eremiobacterota (7 BGC gacha) (3a-c-rasm).
a, Besh 'Ca ning filogenetik pozitsiyalari.Eudormicrobiaceae turlari ushbu tadqiqotda aniqlangan dengiz liniyalariga xos BGC boyligini ko'rsatdi.Filogenetik daraxt barcha 'Ca ni o'z ichiga oladi.MAG Eremiobacterota va GTDBda (89-versiya) taqdim etilgan boshqa fila a'zolari (qavs ichidagi genom raqamlari) evolyutsion fon (usullar) uchun ishlatilgan.Eng tashqi qatlamlar oila darajasida ("Ca. Eudormicrobiaceae" va "Ca. Xenobiaceae") va sinf darajasida ("Ca. Eremiobacteria") tasniflarni ifodalaydi.Ushbu tadqiqotda tasvirlangan besh tur alfanumerik kodlar va tavsiya etilgan binomial nomlar bilan ifodalanadi (Qo'shimcha ma'lumot).b, yaxshi.Eudormicrobiaceae turlari ettita umumiy BGC yadrolariga ega.A2 sinfida BGC ning yo'qligi MAG vakilining to'liq emasligi bilan bog'liq edi (3-jadval qo'shimcha).BGClar “Ca.Amphithomicrobium” va “Ca.Amphithomicrobium” (A va B sinflari) ko'rsatilmagan.c, Barcha BGClar “Ca.Eudoremicrobium taraoceanii Tara okeanidan olingan 623 ta metatrankriptomda ifodalanganligi aniqlandi.Qattiq doiralar faol transkripsiyani bildiradi.To'q sariq doiralar log2-o'zgartirilgan katlama o'zgarishlarini, uy xo'jaligi genini ifodalash tezligi (usullari) ostida va yuqorida ko'rsatadi.d, 'Ca'ni ko'rsatadigan nisbiy mo'l-ko'llik egri (usullari).Eudormicrobiaceae turlari koʻpchilik okean havzalarida va butun suv ustunida (yer yuzasidan kamida 4000 m chuqurlikgacha) keng tarqalgan.Ushbu hisob-kitoblarga asoslanib, biz 'Ca.E. malaspinii' ning 6% gacha bo'lgan prokariot hujayralari chuqur dengiz pelagik donlari bilan bog'liq.Biz turni ma'lum bir chuqurlik qatlami hajmining istalgan qismida topilgan bo'lsa, u erda mavjud deb hisobladik.IO - Hind okeani, NAO - Shimoliy Atlantika, NPO - Shimoliy Tinch okeani, RS - Qizil dengiz, SAO - Janubiy Atlantika, SO - Janubiy okean, SPO - Janubiy Tinch okeani.
Ca ning ko'pligi va tarqalishini o'rganish.Eudormicrobiaceae, biz topganimizdek, ko'pchilik okean havzalarida, shuningdek, butun suv ustunida ustunlik qiladi (3d-rasm).Mahalliy miqyosda ular dengiz mikrobiomalarining 6% ni tashkil qiladi va bu ularni global dengiz mikrobiomasining muhim qismiga aylantiradi.Bundan tashqari, biz Ca ning nisbiy tarkibini topdik.Eudormicrobiaceae turlari va ularning BGC ifoda darajalari eukaryotik boyitilgan fraktsiyada eng yuqori bo'lgan (3c-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 7-rasm), bu zarrachalar, shu jumladan plankton bilan mumkin bo'lgan o'zaro ta'sirni ko'rsatadi.Bu kuzatuv 'Ca'ga biroz o'xshaydi.Ma'lum yo'llar orqali sitotoksik tabiiy mahsulotlar ishlab chiqaradigan Eudoremicrobium BGC'lari Myxococcus41 kabi maxsus metabolitlarni ishlab chiqaradigan boshqa yirtqichlarga o'xshab yirtqich xatti-harakatni ko'rsatishi mumkin (Qo'shimcha ma'lumot va kengaytirilgan ma'lumotlar, 8-rasm).Ca kashfiyoti.Eudormicrobiaceae prokaryotik emas, balki kamroq mavjud (chuqur okean) yoki eukaryotik namunalarda bu bakteriyalar va ularning kutilmagan BGC xilma-xilligi tabiiy oziq-ovqat tadqiqotlari kontekstida nima uchun noaniq bo'lib qolayotganini tushuntirishi mumkin.
Oxir oqibat, biz yangi yo'llar, fermentlar va tabiiy mahsulotlarni kashf qilishda mikrobiomaga asoslangan ishimizning va'dasini eksperimental ravishda tasdiqlashga harakat qildik.BGC ning turli sinflari orasida RiPP yo'li etuk fermentlar tomonidan yadro peptidining turli post-translatsion modifikatsiyalari tufayli boy kimyoviy va funktsional xilma-xillikni kodlashi ma'lum42.Shunday qilib, biz ikkita 'C ni tanladik.Eudoremicrobium' RiPP BGC'lari (3b va 4a-e-rasmlar) har qanday ma'lum BGC (\(\bar{d}\)MIBiG va \(\bar{d}\)RefSeq 0,2 dan yuqori) bilan bir xilga asoslangan.
a–c, In vitro heterolog ekspresyon va in vitro fermentativ tahlillari (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) chuqur dengiz Ca turlariga xos boʻlgan RiPP biosintezi klasteri.E. malaspinii' difosforillangan mahsulotlar ishlab chiqarishga olib keldi.c, yuqori aniqlikdagi (HR) MS / MS (kimyoviy tuzilishda b va y ionlari bilan ko'rsatilgan parchalanish) va NMR (kengaytirilgan ma'lumotlar, 9-rasm) yordamida aniqlangan modifikatsiyalar.d, bu fosforlangan peptid sutemizuvchilarning neytrofil elastazasining past mikromolyar inhibisyonini ko'rsatadi, bu nazorat peptidida va suvsizlantiruvchi peptidda topilmaydi (kimyoviy olib tashlash natijasida suvsizlanish).Tajriba bir xil natijalar bilan uch marta takrorlandi.Masalan, oqsil biosintezining ikkinchi romani \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) klasterining geterologik ifodasi 46 ta aminokislota yadro peptidini o'zgartiruvchi to'rtta etuk fermentning funktsiyasini aniqlaydi.Qoldiqlar HR-MS/MS, izotop yorlig'i va NMR tahlili (Qo'shimcha ma'lumot) tomonidan bashorat qilingan modifikatsiya joyiga muvofiq bo'yalgan.Chiziqli rang berish modifikatsiyaning ikkita qoldiqdan birida sodir bo'lishini ko'rsatadi.Rasm bir yadrodagi barcha etuk fermentlarning faolligini ko'rsatish uchun ko'plab heterolog konstruktsiyalarning to'plamidir.h, Magistral amid N-metilatsiyasi uchun NMR ma'lumotlarining tasviri.To'liq natijalar rasmda ko'rsatilgan.10 kengaytirilgan ma'lumotlar bilan.i, MIBiG 2.0 ma'lumotlar bazasida topilgan barcha FkbM domenlari orasida etuk FkbM oqsil klasteri fermentining filogenetik holati N-metiltransferaza faolligi bilan ushbu oilaning fermentini aniqlaydi (Qo'shimcha ma'lumot).BGC (a, e), prekursor peptid tuzilmalari (b, f) va tabiiy mahsulotlarning taxminiy kimyoviy tuzilmalari (c, g) ning sxematik diagrammalari ko'rsatilgan.
Birinchi RiPP yo'li (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) faqat chuqur dengiz turlarida "Ca.E. malaspinii” va Peptid- prekursor uchun kodlar (4a, b-rasm).Ushbu etuk fermentda biz lantipeptid sintazasining suvsizlanish sohasiga homolog bo'lgan yagona funktsional domenni aniqladik, u odatda fosforlanishni va keyinchalik 43 ni olib tashlashni katalizlaydi (Qo'shimcha ma'lumot).Shuning uchun biz prekursor peptidning modifikatsiyasi bunday ikki bosqichli suvsizlanishni o'z ichiga oladi, deb taxmin qilamiz.Biroq, tandem massa spektrometriyasi (MS/MS) va yadro magnit-rezonans spektroskopiyasi (NMR) yordamida biz polifosforillangan chiziqli peptidni aniqladik (4c-rasm).Kutilmagan bo'lsa-da, biz uning yakuniy mahsulot ekanligini tasdiqlovchi bir nechta dalillarni topdik: ikki xil heterolog xostlar va in vitro tahlillarida suvsizlanish yo'q, etuk fermentning katalitik degidratatsiya joyida mutatsiyaga uchragan asosiy qoldiqlarni aniqlash.hammasi "Ca" tomonidan qayta tiklangan.E. malaspinii genomi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 9-rasm va qo'shimcha ma'lumot) va nihoyat, fosforlangan mahsulotning biologik faolligi, ammo kimyoviy sintezlangan suvsizlangan shakl (4d-rasm).Haqiqatan ham, biz uning neytrofil elastazaga qarshi past mikromolyar proteaz inhibitiv faolligini namoyish qilishini aniqladik, bu ekologik rolni aniqlashga qodir bo'lsa-da, konsentratsiya oralig'ida (IC50 = 14,3 mkM) 44 boshqa tegishli tabiiy mahsulotlar bilan solishtirish mumkin.Ushbu natijalarga asoslanib, biz yo'lni "fosfeptin" deb nomlashni taklif qilamiz.
Ikkinchi holat - Ca ga xos murakkab RiPP yo'li.Eudoremicrobium jinsi (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) tabiiy oqsil mahsulotlarini kodlashi taxmin qilingan (4e-rasm).Bu yo'llar, nisbatan qisqa BGC45 tomonidan kodlangan fermentlar tomonidan o'rnatilgan g'ayrioddiy kimyoviy modifikatsiyalarning kutilayotgan zichligi va xilma-xilligi tufayli alohida biotexnologik qiziqish uyg'otadi.Biz bu oqsilning avval tavsiflangan oqsillardan farqi shundaki, unda poliseramidlarning asosiy NX5N motivi ham, landornamidlarning lantionin halqasi ham yo‘q 46.Umumiy heterologik ifoda naqshlarining cheklovlarini bartaraf etish uchun biz ulardan to'rtta etuk yo'l fermentini (usulini) tavsiflash uchun maxsus Microvirgula aerodenitrificans tizimi bilan birga foydalandik.MS / MS, izotop yorlig'i va NMR kombinatsiyasidan foydalanib, biz ushbu etuk fermentlarni peptidning 46-aminokislota yadrosida aniqladik (4f, g, kengaytirilgan ma'lumotlar, 10-12-rasmlar va qo'shimcha ma'lumotlar).Etuk fermentlar orasida biz RiPP yo'lida FkbM O-metiltransferaza oilasi a'zosi 47 ning birinchi ko'rinishini tavsifladik va kutilmaganda bu etuk fermentning orqa miya N-metilatsiyasini (4h, i va qo'shimcha ma'lumot) joriy etishini aniqladik.Garchi bu modifikatsiya tabiiy NRP48 mahsulotlarida ma'lum bo'lsa-da, amid bog'larining enzimatik N-metilatsiyasi murakkab, ammo biotexnologik jihatdan ahamiyatli reaksiya49 bo'lib, hozirgacha RiPP borozinlar oilasini qiziqtirmoqda.Xususiylik 50,51.Fermentlar va RiPPning boshqa oilalarida bu faollikni aniqlash yangi ilovalarni ochishi va oqsillarning funktsional xilma-xilligini 52 va ularning kimyoviy xilma-xilligini kengaytirishi mumkin.Belgilangan modifikatsiyalar va tavsiya etilgan mahsulot strukturasining g'ayrioddiy uzunligiga asoslanib, biz "pitonamid" yo'l nomini taklif qilamiz.
Funktsional xarakterli fermentlar oilasida kutilmagan enzimologiyaning ochilishi yangi kashfiyotlar uchun atrof-muhit genomikasining va'dasini ko'rsatadi, shuningdek, faqat ketma-ketlik homologiyasiga asoslangan funktsional xulosa chiqarish imkoniyati cheklanganligini ko'rsatadi.Shunday qilib, kanonik bo'lmagan bioaktiv polifosforillangan RiPPlar haqidagi hisobotlar bilan birgalikda bizning natijalarimiz biokimyoviy birikmalarning funktsional boyligi, xilma-xilligi va g'ayrioddiy tuzilmalarini to'liq ochib berish uchun sintetik biologiya sa'y-harakatlari uchun resurslarni ko'p talab qiladigan, ammo muhim ahamiyatga ega ekanligini ko'rsatadi.
Bu erda biz mikroblar tomonidan kodlangan biosintetik potentsial va ularning genomik kontekstini global dengiz mikrobiomasida namoyish qilamiz, natijada olingan manbani ilmiy hamjamiyatga taqdim etish orqali kelajakdagi tadqiqotlarni osonlashtiradi (https://microbiomics.io/ocean/).Biz uning filogenetik va funktsional yangiligining ko'p qismini faqat MAG va SAGlarni qayta qurish yo'li bilan olish mumkinligini aniqladik, ayniqsa, kelajakda biologik qidiruv ishlariga rahbarlik qilishi mumkin bo'lgan etarli darajada foydalanilmagan mikrobial jamoalarda.Garchi biz bu erda "Ca" ga e'tibor qaratamiz.Eudormicrobiaceae nasl-nasabi sifatida, ayniqsa biosintetik jihatdan "iqtidorli", kashf etilmagan mikrobiotada bashorat qilingan ko'plab BGC'lar, ehtimol, atrof-muhit va / yoki biotexnologik ahamiyatga ega bo'lgan birikmalar hosil qiluvchi, ilgari tavsiflanmagan enzimologiyalarni kodlaydi.
Okean havzalarida, chuqur qatlamlarda va vaqt o'tishi bilan global dengiz mikrobial jamoalarini maksimal qamrab olish uchun etarli ketma-ketlik chuqurligiga ega yirik okeanografik va vaqt seriyali tadqiqotlarining metagenomik ma'lumotlar to'plami kiritilgan.Ushbu ma'lumotlar to'plami (Qo'shimcha 1-jadval va 1-rasm) Tara okeanlarida (virus bilan boyitilgan, n = 190; prokaryotik boyitilgan, n = 180) 12,22 va BioGEOTRACES ekspeditsiyasida (n = 480) to'plangan namunalardan olingan metagenomikani o'z ichiga oladi.Gavayi okeani vaqt seriyasi (HOT, n = 68), Bermud-Atlantika vaqt seriyasi (BATS, n = 62)21 va Malaspina ekspeditsiyasi (n = 58)23.Barcha metagenomik fragmentlardan olingan ketma-ket o'qishlar BBMap (v.38.71) yordamida sifat uchun filtrlangan, o'qishlardan ketma-ketlik adapterlarini olib tashlash, sifat nazorati ketma-ketliklariga (PhiX genomlari) moslashtirilgan o'qishlarni olib tashlash va trimq=14, maq=20 yordamida sifatsiz o'qish sifatini yo'q qiladi, maxns = 0 va minlength = 45. Keyingi tahlillar bajarildi yoki belgilangan bo'lsa, QC o'qishlari bilan birlashtirildi (bbmerge.sh minoverlap=16).QC o'qishlari metaSPAdelar yordamida (agar kerak bo'lsa v.3.11.1 yoki v.3.12) qurishdan oldin normallashtirildi (bbnorm.sh maqsad = 40, aql chuqurligi = 0).Olingan iskala kontiglari (keyingi o'rinlarda iskala deb yuritiladi) nihoyat uzunligi (≥1 kb) bo'yicha filtrlandi.
1038 ta metagenomik namunalar guruhlarga bo'lindi va har bir namunalar guruhi uchun barcha namunalarning metagenomik sifat nazorati o'qishlari har bir namunaning qavslariga alohida moslashtirildi, natijada quyidagi juft qavsli guruh ko'rsatkichlari paydo bo'ldi: Tara dengiz viruslari - boyitilgan (190×190), Prokaryotlar boyitilgan (180×180), BioGEOTRACEES, HOT va BATS (610×610) va Malaspina (58×58).Xaritalash Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 yordamida amalga oshirildi, bu o'qishlarni ikkilamchi saytlarga moslashtirish imkonini beradi (-a bayrog'i yordamida).Hizalamalar kamida 45 ta asos uzunlikda, ≥97% identifikatsiyaga va ≥80% oʻqish oraligʻida filtrlangan.Olingan BAM fayllari MetaBAT2 (v.2.12.1)55 uchun jgi_summarize_bam_contig_depths skripti yordamida har bir guruh uchun namunalar ichidagi va namunalararo qamrab olishni ta'minlash uchun qayta ishlandi.Nihoyat, qavslar sezgirlikni oshirish uchun –minContig 2000 va –maxEdges 500 bilan barcha namunalarda MetaBAT2-ni alohida ishga tushirish orqali guruhlangan.va boshqa tez-tez ishlatiladigan bokschilarga qaraganda 10 dan 50 marta tezroq.Mo'l-ko'l korrelyatsiyalarning ta'sirini tekshirish uchun tasodifiy tanlangan metagenomikaning kichik namunasi (Tara okeanining ikkita ma'lumotlar to'plamining har biri uchun 10 ta, BioGEOTRACES uchun 10 ta, har bir vaqt seriyasi uchun 5 ta va Malaspina uchun 5 ta) qo'shimcha ravishda faqat namunalardan foydalanilgan.Ichki namunalar qamrov ma'lumotlarini olish uchun guruhlangan.(Qo'shimcha ma'lumot).
Keyingi tahlilga qoʻshimcha (tashqi) genomlar kiritildi, yaʼni Tara Oceans26 maʼlumotlar toʻplamining quyi toʻplamidan qoʻlda tanlangan 830 ta MAG, GORG20 maʼlumotlar toʻplamidan 5287 SAG va MAR maʼlumotlar bazasidan (MarDB v. 4) 1707 ta izolyatsiya qilingan REF va 682 SAGs) 27. MarDB maʼlumotlar toʻplami uchun genomlar mavjud metamaʼlumotlar asosida tanlanadi, agar namuna turi quyidagi muntazam ifodaga mos kelsa: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] izolyatsiya qilingan'.
Har bir metagenomik konteyner va tashqi genomlarning sifati CheckM (v.1.0.13) va Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0) 58,59 yordamida baholandi.Agar CheckM yoki Anvi'o ≥50% to'liqlik/to'liqlik va ≤10% ifloslanish/ortiqchalik haqida xabar bersa, keyinchalik tahlil qilish uchun metagenomik hujayralar va tashqi genomlarni saqlang.Keyinchalik bu ballar o'rtacha to'liqlik (mcpl) va o'rtacha ifloslanish (mctn) ga birlashtirilib, genom sifatini jamoa mezonlari60 bo'yicha quyidagicha tasnifladi: yuqori sifat: mcpl ≥ 90% va mctn ≤ 5%;yaxshi sifat: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, o'rtacha sifat: mcpl ≥ 50% va mctn ≤ 10%, adolatli sifat: mcpl ≤ 90% yoki mctn ≥ 10%.Keyin filtrlangan genomlar sifat ko'rsatkichlari (Q va Q') bilan quyidagicha bog'langan: Q = mcpl - 5 x mctn Q' = mcpl - 5 x mctn + mctn x (shtammning o'zgaruvchanligi)/100 + 0,5 x log[N50] .(dRep61 da amalga oshirilgan).
Turli ma'lumotlar manbalari va genom turlari (MAG, SAG va REF) o'rtasida qiyosiy tahlil qilish imkonini berish uchun dRep (v.2.5.4) yordamida genom bo'yicha o'rtacha nukleotid identifikatori (ANI) asosida 34 799 genomga havola qilingan.Takrorlanadi)61, 95% ANI chegaralari bilan28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0,95 -nc 0,2) va tur darajasida genom klasterlanishini ta'minlaydigan SpecI63 yordamida bir nusxali marker genlari.Har bir dRep klasteri uchun yuqorida tavsiflangan maksimal sifat ko'rsatkichi (Q') bo'yicha vakillik genomi tanlangan, bu turning vakili hisoblanadi.
Xaritalash tezligini baholash uchun BWA (v.0.7.17-r1188, -a) barcha 1038 metagenomik o'qish to'plamini OMD tarkibidagi 34,799 genom bilan xaritalash uchun ishlatilgan.Sifat bilan boshqariladigan o'qishlar bir tomonlama rejimda xaritaga tushirildi va natijada olingan hizalamalar faqat ≥45 bp uzunlikdagi hizalamalarni saqlab qolish uchun filtrlandi.va identifikatsiya ≥95%.Har bir namuna uchun displey nisbati filtrlashdan keyin qolgan o'qishlar ulushi sifat nazorati ko'rsatkichlarining umumiy soniga bo'linadi.Xuddi shu yondashuvdan foydalangan holda, 1038 metagenomning har biri 5 million qo'shimchaga qisqartirildi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 1c-rasm) va OMD va barcha GEM16 da GORG SAG bilan moslashtirildi.GEM16 katalogidagi dengiz suvidan olinadigan MAG miqdori dengiz suvi namunalarini tanlash (masalan, dengiz cho'kindilaridan farqli o'laroq) metagenomik manbalarning kalit so'rovlari bilan aniqlangan.Xususan, biz “suvli”ni “ekotizim_toifasi”, “dengiz”ni “ekotizim_turi” sifatida tanlaymiz va “habitat”ni “chuqur okean”, “dengiz”, “dengiz okeani”, “pelagik dengiz”, “dengiz suvi” sifatida filtrlaymiz. "Okean", "Dengiz suvi", "Yuzaki dengiz suvi", "Yuzaki dengiz suvi".Natijada 5903 ta MAG (734 ta yuqori sifat) 1823 ta OTU (bu yerda koʻrish) orqali tarqatildi.
Prokaryotik genomlar GTDB-Tk (v.1.0.2)64 yordamida taksonomik izohlangan, standart parametrlari GTDB r89 13-versiyasiga mo'ljallangan. Anvi'o domenni bashorat qilish va qayta chaqirish ≥50% va ortiqcha ≤ 10% asosida eukaryotik genomlarni aniqlash uchun ishlatilgan.Turning taksonomik izohi uning vakili genomlaridan biri sifatida aniqlanadi.Eukaryotlar (148 MAG) bundan mustasno, har bir genom birinchi bo'lib prokka (v.1.14.5)65 yordamida funksional izohlangan, to'liq genlarni nomlagan, kerak bo'lganda "arxeya" yoki "bakteriyalar" parametrlarini aniqlagan, bu esa boshqa bo'lmaganlar uchun ham xabar qilingan. kodlash genlari.va CRISPR hududlari, boshqa genomik xususiyatlar qatorida.FetchMG (v.1.2)66 yordamida universal bir nusxali marker genlarini (uscMG) identifikatsiyalash orqali bashorat qilingan genlarga izoh bering, ortologik guruhlarni tayinlang va eggNOG (v.5.0)68 asosida emapper (v.2.0.1)67 yordamida so'rang.KEGG maʼlumotlar bazasi (2020-yil 10-fevralda chop etilgan) 69. Oxirgi bosqich soʻrov va mavzu qamrovi ≥70% boʻlgan DIAMOND (v.0.9.30)70 yordamida oqsillarni KEGG maʼlumotlar bazasiga moslashtirish orqali amalga oshirildi.Natijalar kutilgan maksimal bit tezligining ≥ 50% bit tezligi (bog'lanishning o'zi) asosida NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline71 ga muvofiq filtrlandi.Gen ketma-ketliklari, shuningdek, standart parametrlar va turli klaster portlashlari bilan antiSMASH (v.5.1.0)72 yordamida genomdagi BGClarni aniqlash uchun kirish sifatida ishlatilgan.Barcha genomlar va izohlar Internetda mavjud bo'lgan kontekstli metama'lumotlar bilan bir qatorda OMDga to'plangan (https://microbiomics.io/ocean/).
Oldin tavsiflangan usullarga o'xshab12,22 biz CD-HIT (v.4.8.1) dan OMD dan bakterial va arxeal genomlardan >56,6 million protein kodlovchi genlarni 95% identifikatsiyaga va qisqaroq genlarga (90% qamrab olish)73 klasterlash uchun foydalandik. > 17,7 million gen klasterlari.Har bir gen klasteri uchun vakili gen sifatida eng uzun ketma-ketlik tanlangan.Keyin 1038 metagenom > 17,7 million BWA (-a) klaster a'zolariga moslashtirildi va natijada olingan BAM fayllari faqat ≥95% identifikatsiya va ≥45 tayanch hizalamalari bilan moslashishni saqlab qolish uchun filtrlandi.Uzunlik normallashtirilgan gen ko'pligi birinchi navbatda eng yaxshi noyob hizalamadagi qo'shimchalarni sanash, so'ngra noaniq xaritalangan qo'shimchalar uchun tegishli maqsadli genlarga ularning noyob qo'shimchalar soniga mutanosib ravishda kasr sonlarini qo'shish orqali hisoblangan.
Kengaytirilgan OMD genomlari ("Ca. Eudormicrobiaceae" dan qo'shimcha MAG'lar bilan, pastga qarang) kengaytirilgan mOTU ma'lumot bazasini yaratish uchun mOTUs74 metagenomik tahlil vositalari ma'lumotlar bazasiga (v.2.5.1) qo'shildi.O'nta uscMGdan faqat oltita bitta nusxali genom (23 528 genom) omon qoldi.Ma'lumotlar bazasini kengaytirish natijasida turlar darajasida 4494 ta qo'shimcha klasterlar paydo bo'ldi.Standart mOTU parametrlari (v.2) yordamida 1038 metagenom tahlil qilindi.644 mOTU klasteridagi jami 989 genom (95% REF, 5% SAG va 99,9% MarDBga tegishli) mOTU profili tomonidan aniqlanmagan.Bu MarDB genomlarini dengiz izolyatsiyasining turli xil qo'shimcha manbalarini aks ettiradi (aniqlanmagan genomlarning aksariyati cho'kindilardan, dengiz xostlaridan va boshqalardan ajratilgan organizmlar bilan bog'liq).Ushbu tadqiqotda ochiq okean muhitiga e'tibor qaratishni davom ettirish uchun, agar ular aniqlanmasa yoki ushbu tadqiqotda yaratilgan kengaytirilgan mOTU ma'lumotlar bazasiga kiritilmasa, biz ularni quyi oqim tahlilidan chiqarib tashladik.
OMDdagi MAG, SAG va REF dan barcha BGClar (yuqoriga qarang) barcha metagenomik iskalalarda aniqlangan BGClar bilan birlashtirildi (antiSMASH v.5.0, standart parametrlar) va BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM domeni )75 yordamida tavsiflanadi.Ushbu xususiyatlarga asoslanib, biz BGClar orasidagi barcha kosinus masofalarini hisoblab chiqdik va ularni (o'rtacha havolalarni) mos ravishda 0,2 va 0,8 masofa chegaralaridan foydalangan holda GCF va GCC ga guruhladik.Bu chegaralar ilgari Evklid masofasidan75 foydalanilgan va kosinus masofasidan foydalangan holda foydalanilgan chegaralarning moslashuvidir, bu esa BiG-SLICE klasterlashning dastlabki strategiyasidagi xatolarning bir qismini engillashtiradi (Qo'shimcha ma'lumot).
Keyin BGClar oldindan tavsiflanganidek parchalanish xavfini kamaytirish va 1038 metagenomda topilmagan MarDB REF va SAGlarni istisno qilish uchun iskalalarda kodlangan faqat ≥5 kb saqlash uchun filtrlandi (yuqoriga qarang).Bu OMD genomi tomonidan jami 39 055 BGC kodlanishiga olib keldi, qo'shimcha 14 106 metagenomik fragmentlarda aniqlangan (ya'ni MAGlarga birlashtirilmagan).Ushbu "metagenomik" BGClar ma'lumotlar bazasida ushlanmagan dengiz mikrobiomalari biosintezi potentsialining ulushini baholash uchun ishlatilgan (Qo'shimcha ma'lumot).Har bir BGC SMASHga qarshi yoki BiG-SCAPE76 da aniqlangan qo'polroq mahsulot toifalari bilan aniqlangan prognozli mahsulot turlariga muvofiq funktsional tavsiflangan.Miqdorni aniqlashda namuna olishning noto'g'riligini oldini olish uchun (GCC/GCF ning taksonomik va funktsional tarkibi, GCF va GCC ning ma'lumotlar bazalarigacha bo'lgan masofasi va GCF ning metagenomik ko'pligi) har bir tur uchun GCF boshiga faqat eng uzun BGCni saqlab, 39 055 BGC yana deduplikatsiya qilindi, natijada jami 17 689 BGC ni tashkil etdi.
GCC va GCF ning yangiligi hisoblangan ma'lumotlar bazasi (BiG-FAMda RefSeq ma'lumotlar bazasi)29 va eksperimental tasdiqlangan (MIBIG 2.0)30 BGC o'rtasidagi masofa asosida baholandi.17,689 vakili BGC ning har biri uchun biz tegishli ma'lumotlar bazasiga eng kichik kosinus masofasini tanladik.Keyinchalik bu minimal masofalar mos ravishda GCF yoki GCC bo'yicha o'rtacha (o'rtacha) olinadi.Agar ma'lumotlar bazasiga masofa 0,2 dan katta bo'lsa, GCF yangi hisoblanadi, bu (o'rtacha) GCF va havola o'rtasidagi ideal ajratishga to'g'ri keladi.GCC uchun biz havolalar bilan uzoq muddatli munosabatlarni mustahkamlash uchun 0,4 ni tanlaymiz, bu GCF tomonidan belgilangan chegaradan ikki baravar yuqori.
BGC ning metagenomik ko'pligi gen darajasidagi profillardan mavjud bo'lgan uning biosintetik genlarining (anti-SMASH tomonidan aniqlangan) o'rtacha ko'pligi sifatida baholandi.Keyin har bir GCF yoki GCC ning metagenomik ko'pligi vakillik BGC yig'indisi sifatida hisoblab chiqilgan (17,689 dan).Keyinchalik bu mo'l-ko'l xaritalar har bir namunadagi mOTU hisobi yordamida uyali kompozitsiya uchun normallashtirildi, bu ham ketma-ketlik harakatlarini hisobga oldi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 1d-rasm).GCF yoki GCC tarqalishi ko'pligi > 0 bo'lgan namunalar ulushi sifatida hisoblangan.
Namunalar orasidagi Evklid masofasi normallashtirilgan GCF profilidan hisoblab chiqilgan.Ushbu masofalar UMAP77 yordamida o'lchami qisqartirildi va natijada olingan o'rnatishlar HDBSCAN78 yordamida nazoratsiz zichlikka asoslangan klasterlash uchun ishlatilgan.HDBSCAN tomonidan foydalaniladigan klaster uchun optimal minimal ballar soni (demak, klasterlar soni) klasterga a'zolikning yig'indisi ehtimolini maksimal darajada oshirish orqali aniqlanadi.Aniqlangan klasterlar (va bu klasterlarning tasodifiy muvozanatlangan kichik namunasi permutatsion ko'p o'zgaruvchan dispersiya tahlilida (PERMANOVA)) PERMANOVA yordamida kamaytirilmagan Evklid masofalariga nisbatan ahamiyati uchun sinovdan o'tkazildi.Namunalarning o'rtacha genom hajmi mOTU ning nisbiy ko'pligi va genom a'zolarining taxminiy genom hajmi asosida hisoblab chiqilgan.Xususan, har bir mOTU ning o'rtacha genom hajmi uning a'zolarining to'liqligi uchun tuzatilgan (filtrdan so'ng) genom o'lchamlarining o'rtacha qiymati sifatida baholandi (masalan, uzunligi 3 Mb bo'lgan 75% to'liq genom 4 o'lchamga ega. Mb).yaxlitligi ≥70% bo'lgan o'rta genomlar uchun.Keyin har bir namuna uchun o'rtacha genom hajmi nisbiy ko'plik bilan o'lchangan mOTU genom o'lchamlari yig'indisi sifatida hisoblab chiqildi.
OMDda genom bilan kodlangan BGClarning filtrlangan to'plami bakterial va archaeal GTDB daraxtlarida (≥5 kb ramkalarda, 1038 metagenomda topilmagan REF va SAG MarDB bundan mustasno, yuqoriga qarang) va ularning filogenetikga asoslangan prognoz qilingan mahsulot toifalarida ko'rsatilgan. genomning holati (yuqoriga qarang).Biz birinchi navbatda ushbu turdagi eng ko'p BGCga ega genomni vakil sifatida ishlatib, ma'lumotlarni turlar bo'yicha qisqartirdik.Vizualizatsiya qilish uchun vakillar yana daraxt guruhlariga bo'lingan va yana har bir hujayrali qatlam uchun eng ko'p miqdordagi BGCni o'z ichiga olgan genom vakil sifatida tanlangan.BGC bilan boyitilgan turlar (kamida 15 dan ortiq BGCga ega bo'lgan bitta genom) ushbu BGClarda kodlangan mahsulot turlari uchun Shannon xilma-xillik indeksini hisoblash yo'li bilan tahlil qilindi.Agar barcha prognoz qilingan mahsulot turlari bir xil bo'lsa, kimyoviy duragaylar va boshqa murakkab BGClar (anti-SMAH tomonidan bashorat qilinganidek) klasterdagi tartibidan qat'i nazar (masalan, oqsil-bakteriotsin va bakteriotsin-proteoprotein sintezi) bir xil mahsulot turiga tegishli hisoblanadi. tanasi).gibrid).
SAMN05421555 biologik namunasiga mos keladigan va qisqa o'qish uchun Illumina SRR3962772 metagenomik o'qish to'plamiga mos keladigan Malaspina namunasi MP1648 namunasidan qolgan DNK (taxminan 6 ng), PacBio sekvensiya protokoliga muvofiq qayta ishlanadi, PacBio sekvensiya protokoliga muvofiq, ultra past kirish kipi PacRTB namunasini ishlatish uchun to'plam (100-980-000) va SMRTbell Express 2.0 shablonini tayyorlash to'plami (100-938-900).Qisqacha aytganda, qolgan DNK Covaris (g-TUBE, 52104) yordamida kesilgan, ta'mirlangan va tozalangan (ProNex boncuklar).So‘ngra tozalangan DNK yakuniy tozalash bosqichidan (ProNex boncuklar) va Sequel II platformasida tartiblashdan oldin kutubxona tayyorlash, kuchaytirish, tozalash (ProNex boncuklar) va o‘lcham tanlash (>6 kb, Blue Pippin)dan o‘tkaziladi.
Dastlabki ikkita rekonstruksiya taxminan.MAG Eremiobacterota uchun biz 99% dan ortiq oltita qo'shimcha ANI aniqladik (ular 3-rasmga kiritilgan), ular dastlab ifloslanish ko'rsatkichlari asosida filtrlangan (keyinchalik genlarning takrorlanishi sifatida aniqlanadi, quyida ko'rib chiqing).Shuningdek, biz "Ca" yorlig'i bilan laganda topdik.Eremiobacterota” ni turli tadqiqotlardan23 topdi va ularni bizning tadqiqotimizdagi sakkizta MAG bilan birgalikda quyi namunalar uchun BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, – bayroq) yordamida 633 ta eukaryotik boyitilgan (>0,8 mkm) namunadan metagenomik o‘qish uchun havola sifatida foydalandi. xaritalash (5 million o'qish).Boyitish uchun maxsus xaritalar (95% hizalanish identifikatori va 80% o'qish qamrovi bilan filtrlangan) asosida yig'ish uchun 10 ta metagenom (kutilgan qamrov ≥5 ×) va kontent korrelyatsiyasi uchun qo'shimcha 49 metagenom (kutilayotgan qamrov ≥1 ×) tanlangan.Yuqoridagi kabi parametrlardan foydalangan holda, bu namunalar biriktirildi va 10 ta qo'shimcha Ca qo'shildi.MAG Eremiobacterota tiklandi.Ushbu 16 MAG (ma'lumotlar bazasida mavjud bo'lgan ikkitasini hisobga olmaganda) kengaytirilgan OMDdagi genomlarning umumiy sonini 34,815 ga yetkazadi.MAGlarga ularning genomik o'xshashligi va GTDBdagi pozitsiyasi asosida taksonomik darajalar beriladi.18 MAG dRep yordamida bir oila ichida 5 turga (intraspesifik ANI >99%) va 3 avlodga (intragenerik ANI 85% dan 94%) ajratildi79.Turlarning vakillari yaxlitlik, ifloslanish va N50 asosida qo'lda tanlangan.Tavsiya etilgan nomenklatura Qo'shimcha ma'lumotda keltirilgan.
"Ca" ning yaxlitligi va ifloslanishini baholang.MAG Eremiobacterota, biz uscMG mavjudligini, shuningdek, CheckM va Anvi'o tomonidan ishlatiladigan nasl-nasab va domenga xos bir nusxali marker gen to'plamlarini baholadik.40 uscMG dan 2 ta dublikatning identifikatsiyasi har qanday potentsial ifloslanishni istisno qilish uchun filogenetik rekonstruksiya (pastga qarang) bilan tasdiqlangan (bu 40 ta marker genlari asosida 5% ga to'g'ri keladi).Beshta vakil MAGning qo'shimcha tadqiqoti 'Ca.Ushbu qayta tiklangan genomlardagi ifloslantiruvchi moddalarning past darajasi Eremiobacterota turlari uchun mo'l-ko'llik va ketma-ketlik tarkibi korrelyatsiyasiga asoslangan interaktiv Anvi'o interfeysidan foydalangan holda tasdiqlangan (Qo'shimcha ma'lumot)59.
Filogenomik tahlil uchun biz beshta vakili MAG "Ca" ni tanladik.Eudormicrobiaceae”, barcha turlari “Ca.Eremiobakterotalar va boshqa fila a'zolari (jumladan, UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria va Planctomycetota) genomi GTDB (r89)13 dan mavjud.Bu genomlarning barchasi bir nusxadagi marker genini olish va BGC annotatsiyasi uchun ilgari tasvirlanganidek izohlangan.GTDB genomlari yuqoridagi yaxlitlik va ifloslanish mezonlariga muvofiq saqlangan.Filogenetik tahlil Anvi'o Phylogenetics59 ish oqimi yordamida amalga oshirildi.Daraxt IQTREE (v.2.0.3) (standart variantlar va -bb 1000)80 yordamida Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81 tomonidan aniqlangan 39 ta tandem ribosoma oqsillarining hizalanishida qurilgan.Uning lavozimlari qisqartirildi.genomning kamida 50% ni qoplash uchun82 va Planctomycecota GTDB daraxt topologiyasi asosida tashqi guruh sifatida ishlatilgan.40 uscMGs bir daraxt bir xil asboblar va parametrlar yordamida qurilgan.
Umumiy mikrobial xususiyatlarni bashorat qilish uchun Traitar (v.1.1.2) standart parametrlari (fenotip, nukleotidlardan)83 dan foydalandik.Biz genomdagi protein kodlovchi gen tarkibiga bog'liq bo'lgan ilgari ishlab chiqilgan yirtqich indeks84 asosida potentsial yirtqich turmush tarzini o'rganib chiqdik.Xususan, biz DIAMOND dan genomdagi oqsillarni OrthoMCL maʼlumotlar bazasiga (v.4)85 bilan solishtirish uchun foydalanamiz –koʻproq sezgir –id 25 –soʻrov qopqogʻi 70–subject-cover 70–top 20 VA tegishli genlarni hisoblaymiz. yirtqichlar va yirtqich bo'lmaganlar uchun marker genlari.Indeks yirtqich va yirtqich bo'lmagan belgilar soni o'rtasidagi farqdir.Qo'shimcha nazorat sifatida biz "Ca" genomini ham tahlil qildik.Entotheonella TSY118 omili Ca bilan bog'lanishiga asoslanadi.Eudoremicrobium (katta genom hajmi va biosintetik salohiyat).Keyinchalik, biz yirtqich va yirtqich bo'lmagan marker genlari va Ca ning biosintetik salohiyati o'rtasidagi potentsial aloqalarni sinab ko'rdik.Eudormicrobiaceae” tadqiqotini oʻtkazdi va bittadan ortiq gen (har qanday turdagi marker genidan, yaʼni yirtqich/yirtqich boʻlmagan gen) BGC bilan bir-biriga mos kelmasligini aniqladi, bu BGC yirtqich signallarni chalkashtirmasligini koʻrsatadi.Shifrlangan replikonlarning qo'shimcha genomik izohi sekretsiya tizimini, pili va flagella86 ni maxsus tekshirish uchun TXSSCAN (v.1.0.2) yordamida amalga oshirildi.
Tara okeanining prokaryotik va eukaryotik boyitish fraktsiyalaridan 623 ta metatrankriptomlarni xaritalash orqali beshta vakil 'Ca xaritasi chizilgan22,40,87 (BWA, v.0.7.17-r1188, -a bayroq yordamida).Eudormicrobiaceae genomi.BAM fayllari 80% oʻqish qamrovi va 95% identifikator filtrlashdan soʻng FeatureCounts (v.2.0.1)88 bilan qayta ishlandi (variantlar bilan FeatureCounts –asosiy -O –fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) Hisoblaydi har bir gen uchun qo'shimchalar soni.Yaratilgan xaritalar gen uzunligi va marker genining ko'pligi mOTU (qo'shish soni > 0 bo'lgan genlar uchun uzunlik bo'yicha normallashtirilgan o'rtacha kiritish soni) uchun normallashtirildi va har bir gen darajasining hujayra boshiga nisbiy ifodasini olish uchun log-22,74 ga aylantirildi, bu ham buni tushuntiradi. ketma-ketlik paytida namunadan namunaga o'zgaruvchanlik.Bunday nisbatlar qiyosiy tahlil qilish imkonini beradi, nisbiy mo'l-ko'llik ma'lumotlaridan foydalanganda kompozitsion muammolarni yumshatadi.Genomning etarlicha katta qismini aniqlashga imkon berish uchun keyingi tahlil qilish uchun 10 mOTU marker genidan faqat 5 dan ortiq bo'lgan namunalar ko'rib chiqildi.
'Ca ning normallashtirilgan transkriptom profili.E. taraoceanii UMAP yordamida o'lchamlilikni kamaytirishga duchor bo'ldi va natijada tasvir ifoda holatini aniqlash uchun HDBSCAN (yuqoriga qarang) yordamida nazoratsiz klasterlash uchun ishlatilgan.PERMANOVA identifikatsiya qilingan klasterlar orasidagi farqlarning ahamiyatini dastlabki (qisqartirilmagan) masofa fazosida sinab ko'radi.Ushbu shartlar orasidagi differentsial ifoda genom bo'ylab sinovdan o'tkazildi (yuqoriga qarang) va 6 ta funktsional guruhda 201 ta KEGG yo'llari aniqlandi, xususan: BGC, TXSSCAN dan sekretsiya tizimi va flagellar genlari, degradatsiya fermentlari (proteaza va peptidazalar), yirtqich va bo'lmagan. yirtqich genlar.yirtqich indeks belgilari.Har bir namuna uchun biz har bir sinf uchun o'rtacha normallashtirilgan ifodani hisoblab chiqdik (BGC ifodasining o'zi ushbu BGC uchun biosintetik genlarning o'rtacha ifodasi sifatida hisoblanganiga e'tibor bering) va shtatlar bo'ylab ahamiyati uchun sinovdan o'tkazildi (FDR uchun sozlangan Kruskal-Uollis testi).
Sintetik genlar GenScript-dan, PCR primerlari esa Microsynth-dan sotib olindi.DNKni kuchaytirish uchun Thermo Fisher Scientific kompaniyasidan fuzion polimeraza ishlatilgan.DNKni tozalash uchun NucleoSpin plazmidlari, NucleoSpin jeli va Macherey-Nageldan olingan PCR tozalash to'plami ishlatilgan.Cheklash fermentlari va T4 DNK ligazasi New England Biolabs kompaniyasidan sotib olindi.Izopropil-b-d-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) (Biosinth) va 1,4-ditiotreitol (DTT, AppliChem) dan boshqa kimyoviy moddalar Sigma-Aldrichdan sotib olindi va keyingi tozalashsiz foydalanildi.Antibiotiklar xloramfenikol (Cm), spektinomitsin dihidroxlorid (Sm), ampitsillin (Amp), gentamitsin (Gt) va karbenitsillin (Cbn) AppliChem kompaniyasidan sotib olindi.Bacto Trypton va Bacto Yeast Extract media komponentlari BD Biosciences kompaniyasidan xarid qilingan.Sekvensiya uchun tripsin Promega'dan sotib olindi.
Gen ketma-ketligi anti-SMASH prognoz qilingan BGC 75.1 dan olingan.E. malaspinii (Qo'shimcha ma'lumot).
EmbA genlari (lokus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gen_5), embM (lokus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gen_4) va embAM (shu jumladan, intergen mintaqalari) ketma-ketlikda optimallashtirilgan va sintetik konstruksiyalarsiz pUCR5 d E da ifodalash uchun qachon.embA geni pACYCDuet-1 (CmR) va pCDFDuet-1 (SmR) ning birinchi ko'p klonlash joyiga (MCS1) BamHI va HindIII bo'linish joylari bilan subklonlangan.EmbM va embMopt genlari (kodon optimallashtirilgan) MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) ga BamHI va HindIII bilan subklonlashtirildi va pCDFDuet-1 (SmR) va pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) ning ikkinchi ko'p klonlash joyiga joylashtirildi. NdeI/ChoI.embAM kassetasi BamHI va HindIII parchalanish joylari bilan pCDFDuet1 (SmR) ga subklonlangan.Orf3/embI geni (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) EmbI_OE_F_NdeI va EmbI_OE_R_XhoI primerlari yordamida bir-biriga o'xshash kengaytmali PCR orqali tuzilgan, NdeI/XhoImb va p1DF1lig'i yordamida hazm qilingan. cheklash fermentlari (qo'shimcha jadval).6).Cheklov fermentini hazm qilish va bog'lash ishlab chiqaruvchining protokoliga (New England Biolabs) muvofiq amalga oshirildi.